产品特点：

构建 cDNA 文库、蛋白质的体外翻译和 RT-PCR 方法检测稀有的 mRNA 等研究常常需要从总 RNA 中分离 mRNA，mRNA 只占总 RNA 的 1%左右，但由于带 poly（A）尾巴，所以可以通过与 Oligo（dT）纤维素的亲和结合而与其他RNA（如 rRNA、tRNA 等）分离开。本产品专门用于从全血中一站式提取 mRNA，它具有下列特点：

1. 一站式，是由我公司的高效、全血 RNA 提取试剂和 mRNA 提取试剂两个产品整合而成，即开即用，非常方便。

2. 可以处理 0.5-1.5 mL 的全血，能得到约 2-3 ug 总 RNA，其中 1-5%为 mRNA。

3. 提供的 Oligo（dT）纤维素吸附能力强，每克可以吸附 50-80 OD 的 mRNA相当于 2000-3000 ug mRNA。

4. mRNA 提取过程操作简单，只需要离心就可以完成，免去了常规的灌柱、洗柱等繁琐操作，样品也不会被稀释。

1. 得到的 mRNA 可以直接用于构建 cDNA 文库、蛋白质的体外翻译和RT-PCR。

常温运输，Oligo(dT)纤维素-20℃保存，RNA 洗液 4℃保存，其余产品可以室温放置。本产品有效期一年。

使用方法：

一：用柱式血液 RNAout 提取总 RNA

1. 将 0.2-1.5 mL 新鲜或解冻后的抗凝全血加入到 1.5 mL 塑料离心管中。

2. 12000-15000 g 室温离心 3 分钟，弃上清(血浆)。如果此时血液细胞沉淀体积大于 0.2 mL， 则需要减少血液的使用量，具体减少量需根据具体情况决定，因为各个个体(尤其是患者)血液中白细胞数目差别很大。

3. 将 1 mL 溶液 A 加入到血液细胞沉淀中，用移液枪吹打沉淀使细胞裂解。

4. 将 0.3 mL 的溶液 B 加入到离心管中，剧烈震荡 30 秒。

5. 和 0.2 mL 氯仿加入到离心管中，剧烈震荡 30 秒。

6. 12000-15000 g 室温离心 3-5 分钟，将上清液(为无色或浅红色，约 0.5-0.9mL)转移到另一干净离心管中。注意：转移的液体不要超过 0.7 mL，否则下一步不能加入等体积的溶液 C。为防止污染，留 100 uL 左右的上清液。

下层有机相一般呈深红色，中间层为白色，含有 DNA，蛋白质和其他细胞破碎物，避免触及或吸取。

7. 加入等体积的溶液 C，充分颠倒混匀。

8. 分两次将溶液转移到离心吸附柱中，每次转移后 12000-15000 g 室温离心半分钟，弃穿透液。

9. 加 0.7 mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。

10. 如果有必要，可以再加 0.3 mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。

注意：增加此步可以进一步提高 RNA 的纯度。

11. 室温 12000-15000 g 离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响 RNA 的后续反应。

12. 将离心吸附柱转移到一个 RNase-free 的收集管中，加入 50-100 uL RNA洗脱液，室温放置 1-2 分钟。

13. 12000-15000 g 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

14. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做 Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行 RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的 RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。

15. RNA 产量产率测定：将 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在 OD260 的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA 浓度（1 OD260 的RNA=40 μg/mL），进而计算出 RNA 的产量（浓度 X 体积)和产率(RNA 产量/组织用量)。人血 RNA 产率一般为 2-5 ug/mL。无污染的总 RNA 的OD260/OD280 一般在 2.0 左右。

二：从血液总 RNA 中提取血液 mRNA

本产品提供本产品提供 25 mg Oligo(dT)纤维素，每克 Oligo(dT)纤维素能够结合50-80 OD 的 mRNA。

1. 在一个 1.5 mL 塑料离心管中称取 1 mg Oligo (dT)纤维素。将 0.5 mL 结合液加入到一管装有 1 mg Oligo (dT)纤维素的离心管中，混匀后室温放置 5分钟。也可以将 250 uL 结合液加入到装有 25 mg Oligo(dT)纤维素的离心管中，每次取 10 uL（相当于 1 mg Oligo (dT)纤维素）与 0.5 mL 结合液

混匀，室温放置 5 分钟。剩余部分放-80℃保存。

2. 200-2000 g 离心 30 秒，小心吸弃上清后留 Oligo (dT)纤维素沉淀待用。

3. 将在节中提取的两管相同的总 RNA（每个样品用 50 uL）混合在一起得到总 RNA 100 uL，65℃加热 5 分钟。也可以只用一管总 RNA，但需要补水到 100 uL，再 65℃加热 5 分钟。

4. 加入等体积的结合液，混匀后冷却到室温后，全部转移到装有 Oligo(dT)纤维素的离心管中，

5. 混匀后室温放置 5 分钟，期间颠倒混匀数次。

6. 4℃ 200-2000g 离心 5 分钟，小心将上清转移到一个离心管中。此上清液是去除了 mRNA 的总 RNA。冰上放置待用。

7. 加入 0.5 mL 结合液，混匀后 4℃ 200-2000g 离心 5 分钟，小心弃上清。

8. 重复上步 2-4 次。

9. 加入 50 uL RNA 洗脱液，混匀后 4℃ 200-2000g 离心 5 分钟，小心收集上清（mRNA）。

10. 重复上步 1-3 次。

11. 将各次收集的 mRNA 混合用于下步的核酸沉淀。

三：用微量核酸沉淀剂沉淀

mRNA

1. 按 2:1 的比例将微量核酸沉淀剂与 mRNA 溶液混合。微量核酸沉淀剂用前需要摇匀。

2. 室温 15000 g 离心 10 分钟(如果 mRNA 含量在 2 ng 以下，建议离心 30分钟)。

3. 小心弃上清后，加入 1 mL 自备的 75%乙醇，振荡混匀。

5. 再短暂离心后小心吸弃上清，沉淀即为回收的 mRNA 沉淀，可溶于 RNA 洗脱液中待用。