原理及特点：

PCR标记的原理是用带标记的dNTP进行PCR，得到的PCR产物将带有标记，可以直接用于杂交试验。

本产品是在上述原理的基础上开发，它具有下列特点：

1. 一站式，本试剂盒提供经过优化的试剂，不需要用户自己摸索。

2. 足够10次50 uL体系的常规PCR（用于制备标记反应的模板和设置对照反应）和5次50 uL体系的标记反应。

3. 标记可以得到ug级的双链DNA探针或约700ng的单链DNA探针，足够多次杂交实验用。

4. 既可用于制备双链探针，也可以用于单链探针。

5. 90604A需自备含标记核苷酸的dNTP， 90604B和90604C分别含生物素和地高辛标记的底物。自备的标记包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。

6. 本产品得到的探针参入率一般为4-5%（每100个核苷酸中有4-5个将带有非同位素标记），有效降低了空间阻碍，检测效果。

7. 可以用于Southern 和Northern Blot、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等分析。

低温运输，-20℃保存，有效期一年

使用方法：

一：准备工作

1. 按常规的方法设计PCR引物，使探针长度在400-800bp之间。过短则标记参入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。

2. 根据PCR引物优化PCR条件。

3. 由于标记的dNTP比较珍贵，所以本试剂盒不推荐以基因组DNA或其他复杂DNA为模板直接进行PCR标记，而是建议采取下述的两步法标记来提高成功率，即先制备非标记PCR产物，再以之为模板制备标记的PCR产物。

二：非标记PCR产物的制备

4. 设置50 uL PCR的反应体系

5. 按已经优化的PCR参数进行PCR。

6. 电泳检测和胶回收所需的PCR产物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1ug左右的PCR产物（具体取决于PCR产物的长度）。注意：采取胶回收而不是PCR回收以避免残留引物干扰后续的标记PCR。

三：标记PCR反应（做一个不加标记的对照用于定量）

说明：在设置下面反应时，如果加一种引物，就得到单链标记的PCR产物；如果加两种引物，则得到双链标记的PCR产物。由于双链PCR探针在杂交前虽然要变性成单链后使用，但杂交时变性的双链彼此还会复性，这种复性会与探针-靶DNA杂交反应相竞争，降低杂交效率，因此强烈推荐使用单链标记的DNA探针。

注意：本试剂盒提供的dNTP混合物中，标记底物与非标记底物的比例已经进过优化，如果自备标记dUTP，其与dTTP的比例需要优化，标记不同，比例不同。对DIG-11-dUTP，比例1：3；对BrdUTP，比例为1：1。

7. 按第5步的PCR参数进行标记PCR，但需要进行下列修改：一是循环数增加到35-55个循环。由于模板为纯化后的PCR产物，探针对扩增长度完整性要求不高（长度不均的探针由于能形成网络结构，效果反而更好），所以可以增加循环数；二是延伸时间增加15秒，因为标记dUTP参入到DNA的速度比常规的dTTP慢；三是降低复性温度5-7℃，因为标记核苷酸参入到DNA后，新模板的Tm值将降低。

8. 标记探针的定量：取标记反应和对照反应的产物1-5 uL，在琼脂糖凝胶上跟浓度已知的DNA marker一起电泳，并判断探针的浓度。由于标记反应的PCR产物中额外带有非同位素的配体（生物素，地高辛等）、因此其泳动速度将慢于非标记PCR产物（但同位素标记不能用此法）

注意：如果扩增的是单链DNA探针，其结合EB的能力远低于双链DNA（EB是嵌合到双链碱基对之间的，而单链DNA没有碱基对，只有一些局部区域折叠形成的有限双链区，因此能结合的EB很少），因此EB染色的强弱不能准确反应DNA的浓度，可以采用银染定量（跟marker比较）。一般100ng模板按上述条件经过单链PCR扩增可得到700ng左右探针。

9. 剩余的PCR标记产物可以不经过纯化，直接加入（对单链PCR探针）杂或加热变性并急冷后加入（对双链PCR探针）到杂交液中使用。如果暂时不用请放-20℃长期保存。如果需要纯化，请使用乙酸铵/乙醇沉淀法。