产品特点：

研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前最通用的方法是5′-RACE法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是Frohman发明的、通过PCR快速克隆cDNA末端的技术，它在不建立cDNA文库的前提下，利用已知cDNA序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其5′-端序列。本试剂盒就是根据5′-RACE原理而开发，它具有下列特点：

1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。

2. 反应条件经过精心优化，包括使用无RNase H活性的MMLV和优化的引物。

低温运输、-20℃保存、有效期一年。

1. 变性模板RNA：将1 μg mRNA或5 μg 总RNA加入到一个RNase-free的PCR管中，补RNase-Free水到9 μL，65℃保温5分钟后短暂离心，立即放冰上待用。如果RNA浓度偏低，体积超过9 μL,可以使用本公司的核酸浓缩剂（需另购,产品编号为110801-30）浓缩到所需的体积。

2. 设置RT反应（用户可以根据需要设阴性对照）：在上步的含变性后的RNA模板的PCR管

3. 37℃保温60分钟， 42℃保温30分钟， 50℃保温10分钟，75℃保温10分钟使逆转录酶变性。

4. 短暂离心5秒后待用。

5. 在PCR管中加入40 μL微量核酸沉淀剂（本产品含不溶的核酸助沉剂，用前需要充分摇匀再取用），震荡混匀。

6. 室温12000 rpm离心15分钟，小心吸弃上清。

7. 加入1mL 自备75%乙醇，室温12000 rpm离心5分钟，小心吸弃上清。

8. 短暂离心数秒，小心吸弃残留液体后，稍微晾干后加入10 μL RNase-free水，充分吹打溶解，得到cDNA溶液。注意：为保证加尾效率，溶解cDNA的RNase-free水不要超过10 μL。

9. 加尾反应：在10 μL cDNA溶液中加10 μL 2×TdT Buffer（含dATP）和1 μL TdT酶，轻柔吹打混匀。

10. 37℃保温15分钟进行加尾反应，然后75℃保温3分钟灭活末端转移酶。

11. 加入0.5 mL RNase-free水稀释加尾反应体系。此稀释液将作为PCR的模板。

12. 轮PCR：用不同量的稀释后的加尾反应液设置PCR反应

13. 按下列条件进行 PCR（注：应根据实际情况选择适当的退火温度）。

第 1 次循环：94℃ 5 分，48-52℃ 2 分，72℃ 4 分

第 2-30 次循环：94℃ 40 秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分

延伸：72℃ 15 分

14. 取 10-20μL PCR 产物进行琼脂糖电泳电泳检查 PCR 结果，如果一条清晰的条

带，则可以不做后续的第二轮 PCR，而直接进行 DNA 测序或 TA 克隆。

15. 第二轮 PCR：如果轮 PCR 没有一条清晰的条，则带从 4 管 PCR 产物中各

取 1μL 分别加入到 20 μL RNase-free 水中进行稀释，然后各取 1 μL 分别作

为 4 管第二轮 PCR 的模板

16. 按下列条件进行 PCR：第 1-30 次循环（94℃ 40 秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3

分），延伸：72℃ 15 分

17. 取 10-20μL 第二轮 PCR 产物进行琼脂糖电泳，一般都会有一个样品有清晰的

条带出现，则可以直接进行 DNA 测序或 TA 克隆。