摘要

本文详细阐述了柔嫩艾美耳球虫ADF重组卡介苗的构建及其免疫保护性研究。通过RT-PCR技术扩增ADF基因，并克隆至卡介苗表达载体中，构建了重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF。实验结果显示，重组卡介苗通过滴鼻免疫方式具有显著的抗球虫效果，为鸡球虫病的预防提供了新的策略。

引言

鸡球虫病是一种由艾美耳属球虫寄生在鸡的肠道引起的寄生性原虫病，其中柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）是最主要的病原体之一。该病分布广泛，感染率高达60%～70%，死亡率可超过80%，对养鸡业造成了巨大的经济损失。目前，预防和治疗鸡球虫病的主要措施是使用化学药物和抗球虫疫苗。然而，药物残留问题和对环境的污染限制了化学药物的使用，而现有的疫苗免疫效果并不理想。因此，开发新型高效的疫苗成为鸡球虫病防控的重要研究方向。

重组卡介苗（rBCG）作为一种致弱的活疫苗，具有较强的免疫佐剂作用，是表达外源基因的理想活菌疫苗载体。ADF（Actin Depolymerizing Factor）蛋白与柔嫩艾美耳球虫入侵鸡的肠上皮细胞有关，可以结合肌动蛋白，是潜在的疫苗候选抗原。本研究旨在构建柔嫩艾美耳球虫ADF基因重组卡介苗，并评估其免疫保护效果，为鸡球虫病的预防提供新的策略。

材料与方法

1. 实验材料

• 菌株与质粒：大肠杆菌DH5α、卡介苗BCG、穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361。

• 试剂：某品牌RNA提取试剂、某品牌RT-PCR试剂盒、某品牌限制性内切酶、某品牌T4 DNA连接酶、某品牌质粒提取试剂盒、某品牌IPTG、某品牌SDS-PAGE试剂盒等。

• 实验动物：SPF级雏鸡。

2. 方法

• ADF基因的克隆：从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA，使用RT-PCR技术扩增ADF基因的完整开放阅读框（ORF），并克隆至pMD18-T载体中，进行测序验证。

• 重组质粒的构建：将ADF基因分别克隆至穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中，构建重组质粒pMV261-ADF和pMV361-ADF。使用限制性内切酶进行双酶切，T4 DNA连接酶进行连接，转化至大肠杆菌DH5α中，筛选阳性克隆并进行测序验证。

• 重组卡介苗的构建：将重组质粒电穿孔转化至卡介苗BCG中，筛选阳性重组卡介苗。

• 动物免疫实验：将构建的重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF疫苗通过滴鼻、口服、颈部皮下注射三种途径接种SPF级雏鸡，BCG免疫组作为对照。免疫后经口接种柔嫩艾美耳球虫卵囊，观察并记录鸡的发病情况、盲肠病变、卵囊产量等指标。

• 免疫效果评价：通过抗球虫指数（ACI）评价重组卡介苗疫苗的保护效果。同时，取免疫鸡的血清用ELISA方法检测抗体水平，取鸡的脾脏测定脾淋巴细胞内CD4+T、CD8+T细胞的百分率变化情况。

实验结果

1. ADF基因的克隆与测序

   成功从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊中扩增出ADF基因的完整ORF，大小为357bp，编码118个氨基酸。测序结果与已报道的序列完全一致，说明ADF基因在不同种和不同地理株间均具有高度的保守性。

2. 重组质粒的构建与测序

   成功将ADF基因克隆至穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中，构建重组质粒pMV261-ADF和pMV361-ADF。测序结果显示，ADF基因正确插入载体中，且载体序列完整无误。

3. 重组卡介苗的构建与筛选

   成功将重组质粒电穿孔转化至卡介苗BCG中，筛选获得阳性重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF。通过PCR和测序验证，确认ADF基因已正确整合至卡介苗基因组中。

4. 动物免疫实验与免疫效果评价

   将构建的重组卡介苗通过滴鼻、口服、颈部皮下注射三种途径接种SPF级雏鸡。结果显示，滴鼻免疫方式的抗球虫效果最好。重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF的ACI值分别为161.47和169.21，显著高于BCG免疫组（P<0.01）。同时，免疫鸡的抗体水平显著升高，CD4+T淋巴细胞的百分率也显著增加（P<0.01）。

   为进一步验证IL-2基因对重组卡介苗免疫效果的增强作用，将鸡的IL-2基因与ADF基因同时克隆入载体中，制备两株重组卡介苗pMV261-ADF-IL-2和pMV361-ADF-IL-2。体外试验表明，滴鼻方式免疫pMV261-ADF-IL-2和pMV361-ADF-IL-2的抗球虫指数ACI可达到176.08和172.89，其抗体水平和CD4+T、CD8+T淋巴细胞百分率与对照组相比差异均极显著（P<0.01）。

讨论

1. ADF基因作为疫苗候选抗原的潜力

   ADF蛋白与柔嫩艾美耳球虫入侵鸡的肠上皮细胞有关，是潜在的疫苗候选抗原。本研究成功构建了柔嫩艾美耳球虫ADF基因重组卡介苗，并通过动物免疫实验验证了其显著的抗球虫效果。这表明ADF基因作为疫苗候选抗原具有巨大的潜力。

2. 重组卡介苗的免疫佐剂作用

   重组卡介苗作为一种致弱的活疫苗，具有较强的免疫佐剂作用。本研究中，重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF通过滴鼻免疫方式显著提高了鸡的抗球虫指数，抗体水平和CD4+T淋巴细胞的百分率也显著增加。这表明重组卡介苗在鸡球虫病预防中具有显著的免疫佐剂作用。

3. IL-2基因对重组卡介苗免疫效果的增强作用

   IL-2是细胞介导免疫反应（CMI）的主要细胞因子，由TH-1型细胞产生。本研究中将鸡的IL-2基因与ADF基因同时克隆入载体中，制备了两株重组卡介苗pMV261-ADF-IL-2和pMV361-ADF-IL-2。结果显示，IL-2基因能显著提高重组卡介苗的抗球虫指数、抗体水平和CD4+T、CD8+T淋巴细胞百分率。这表明IL-2基因对重组卡介苗的免疫效果具有显著的增强作用。

4. 研究的创新与应用前景

   本研究首次构建了柔嫩艾美耳球虫ADF基因重组卡介苗，并评估了其免疫保护效果。通过动物免疫实验验证了其显著的抗球虫效果，为鸡球虫病的预防提供了新的策略。同时，本研究还探讨了IL-2基因对重组卡介苗免疫效果的增强作用，为进一步优化疫苗提供了新思路。未来，本研究成果有望应用于鸡球虫病的防控实践中，为养鸡业的健康发展提供有力保障。

结论

本研究成功构建了柔嫩艾美耳球虫ADF基因重组卡介苗pMV261-ADF和pMV361-ADF，并通过动物免疫实验验证了其显著的抗球虫效果。同时，本研究还探讨了IL-2基因对重组卡介苗免疫效果的增强作用。结果表明，ADF基因作为疫苗候选抗原具有巨大的潜力，重组卡介苗在鸡球虫病预防中具有显著的免疫佐剂作用，IL-2基因能显著提高重组卡介苗的免疫效果。本研究为鸡球虫病的预防提供了新的策略，为养鸡业的健康发展提供了有力保障。未来，将进一步优化疫苗制备工艺，提高疫苗的稳定性和免疫效果，为鸡球虫病的防控实践提供更为有效的解决方案。