摘要：本文介绍了一种新型的高通量小间距细胞电穿孔装置，采用电绝缘的聚氯乙烯（PVC）薄膜制作，电极间距为80μm。该装置不仅显著降低了细胞电穿孔所需的电压，提高了实验操作的安全性，还实现了高通量操作，提升了实验效率。尽管电穿孔转化效率有所降低，但通过进一步优化实验参数，该装置在基因工程领域具有广阔的应用前景。

引言

细胞电穿孔技术，又称电转染技术，是一种常用的细胞转染方法。该技术通过施加一定的电场强度可逆地击穿细胞膜，在细胞膜上形成小孔或通路，从而将遗传物质引入细胞内。自1982年由Neumann等首次报道以来，电穿孔技术已成为基因工程领域和新兴的合成生物学领域的重要环节。传统的细胞电穿孔装置通常需要几百伏到几千伏的电压，操作危险且依赖人工，难以实现自动化运行。

为解决传统电穿孔仪的局限，微型电穿孔技术在2000年被首次提出。微型电穿孔仪虽然提高了细胞存活率和细胞转染率，甚至实现了对单个细胞的电穿孔操作，但处理的细胞数量偏少，难以满足生物学实际应用中对细胞数量的需求。为此，本研究设计了一种高通量小间距细胞电穿孔装置，旨在降低细胞电穿孔所需电压，提高细胞处理量，并实现高通量操作。

材料与方法

1. 装置设计与制作

本研究采用电绝缘的聚氯乙烯（PVC）薄膜制作了一种电极间距为80μm的小间距电穿孔装置。PVC薄膜的厚度决定了电极间距，本实验采用厚度为0.08mm（80μm）的PVC薄膜。装置的出入口可以通过硅胶软管与蠕动泵或注射器相连，实现高通量操作。

1. 实验材料与试剂

• 菌株：大肠杆菌MG1655（购自某公司）和毕次酵母GS115（购自某公司）。

• 质粒：pUC57（购自某公司，质粒浓度为122.127ng/μL）和pPIC9K（购自某公司，质粒浓度为224.600ng/μL）。

• 试剂：SOC缓冲液、LB（Luria-Bertani）琼脂培养基、卡那霉素、MD（Minimal Dextrase）培养基、D-山梨醇溶液。

1. 实验设备

• 某品牌电穿孔仪：威尼德，用于提供脉冲电压。

• 注射泵：用于控制细胞液的注入速度。

• 硅胶软管：用于连接装置的出入口与蠕动泵或注射器。

1. 实验参数

• 脉冲电压：通过威尼德电穿孔仪的XXX模式设定。

• 电穿孔腔体体积：2μL。

• 脉冲发生器：每5秒施加一次脉冲电压。

• 注射泵速度：0.4μL/s。

1. 实验过程

• 大肠杆菌MG1655转染质粒pUC57实验：

1. 往100μL的感受态细胞液内加入1μL质粒，混匀。

2. 通过注射泵以0.4μL/s的速度注入电穿孔装置进行电穿孔，电压分别为200V、220V、240V、260V、280V和300V。

3. 电穿孔后，将细胞液与900μL SOC缓冲液混合，放入37℃摇床复苏1小时。

4. 将细胞液涂布于含卡那霉素（终浓度为50mg/μL）的LB琼脂培养基上，放入37℃温箱过夜培养，第2天早上统计菌落数。

• 毕次酵母GS115转染质粒pPIC9K实验：

1. 往100μL的感受态细胞液内加入1μL质粒，混匀。

2. 通过注射泵以0.4μL/s的速度注入电穿孔装置进行电穿孔，电压为150V。

3. 电穿孔后，将细胞液与900μL 1mol/L的D-山梨醇溶液混合，放入30℃摇床复苏1小时。

4. 将细胞液涂布于MD培养基平板上，放入30℃温箱中培养3天，第4天早上统计菌落数。

实验结果

1. 大肠杆菌MG1655转染质粒pUC57实验结果

在6种测试电压下（200V、220V、240V、260V、280V和300V），LB琼脂板上均有菌落长出，表明这些电压条件下都有细胞成功电穿孔。然而，相比于采用1mm标准电击杯（通常施加1.8kV脉冲电压），该电穿孔装置成功进行电穿孔所需的电压降低了一个数量级，但电穿孔转化效率也降低了一个数量级。

1. 毕次酵母GS115转染质粒pPIC9K实验结果

实验组的MD平板上有菌落长出，但菌落数量比对照组（采用1mm标准电击杯，施加1.5kV脉冲电压）低了一个数量级。这表明，相比于1mm标准电击杯，该电穿孔装置成功进行电穿孔所需的电压降低了一个数量级，但电穿孔转化效率同样降低了一个数量级。

讨论

本研究设计的高通量小间距细胞电穿孔装置显著降低了细胞电穿孔所需的电压，提高了实验操作的安全性。同时，通过硅胶软管与蠕动泵或注射器的连接，实现了高通量操作，提高了实验效率。然而，电穿孔转化效率比1mm标准电击杯低了一个数量级，这可能与以下因素有关：

1. 电穿孔腔横截面的长宽比：该装置电穿孔腔横截面的长宽比（长度2mm、宽度0.08mm）较大，导致更多细胞处于靠近电极的区域。而该区域在施加电压过程中的温度、pH变化较大，可能影响电穿孔效率。

2. 电压波形与持续时间：针对该电穿孔装置所采用的电压波形、持续时间等参数可能不够理想，需要进一步优化。

策略与创新

为提高电穿孔效率，可以从以下几个方面进行优化：

1. PVC薄膜通道形状：通过改变PVC薄膜通道的形状，调整电穿孔腔横截面的长宽比，以减少温度、pH变化对电穿孔效率的影响。

2. 电压波形与持续时间：进一步优化电压波形、大小及持续时间等参数，以提高电穿孔效率。

3. 自动化与智能化：随着科技的发展，可以设计智能电穿孔系统，实时监测细胞状态和电场参数，自动调整电穿孔条件，以实现最佳的实验效果。

应用前景

尽管电穿孔转化效率有所降低，但高通量小间距细胞电穿孔装置在基因工程领域仍具有广阔的应用前景。特别是在需要高通量操作、细胞数量需求较大的实验中，该装置能够显著提高实验效率，降低操作风险。此外，通过进一步优化实验参数，该装置有望在未来实现更高的电穿孔效率，为基因治疗、药物研发等领域提供更加高效的工具。

结论

本研究设计了一种高通量小间距细胞电穿孔装置，采用电绝缘的聚氯乙烯（PVC）薄膜制作，电极间距为80μm。该装置显著降低了细胞电穿孔所需的电压，提高了实验操作的安全性，并实现了高通量操作。尽管电穿孔转化效率有所降低，但通过进一步优化实验参数，该装置在基因工程领域具有广阔的应用前景。未来，随着技术的不断发展，该装置有望在细胞治疗、基因治疗、药物研发等领域发挥更加重要的作用。