蛋白质纯化技术工作较为复杂，从细胞中提取的蛋白质或从含有蛋白质的溶液中经过沉淀、梯度离心、盐析等方法得到的蛋白质经常含有杂质，要去除这些杂质，同时又要保持蛋白质的生物学活性。因为用以上方法获取的蛋白质常含有杂质，为了在保持蛋白质的生物学活性同时，又去除这些杂质，就要根据不同的蛋白质制定出相应的策略，采用不同的方法。这就叫做蛋白质纯化技术。 蛋白质的纯化方法主要是利用不同蛋白质之间的相似性与差异，依据蛋白之间的相似性可以去除非蛋白物质，再根据蛋白质的差异性将目的蛋白分离出来。

一、电泳：

在克隆基因表达产物的检测分析过程中，电泳是常用的方法，但在纯化蛋白时，通常都不采用电泳的方法。由于某些特殊的目的，需要用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化蛋白质，常用下述方法进行：①从电泳后的凝胶上切下所需的相应条带，将凝胶压碎，用缓冲液浸泡，使其中的蛋白质扩散出来，从而获得纯化的蛋白质。此法简单但回收率低。②将电泳后的凝胶用电洗脱的方法使蛋白质从凝胶转移到溶液中，从而达到纯化的目的。此法快速，回收率高，但需要特殊的电泳装置。

二、色谱法：

色谱法（chromatography）是蛋白纯化中最常用的一种方法，这种方法既可以制备大量的纯化蛋白质，又可以保持蛋白质的生物学活性。色谱的种类很多，可分为常规色谱和高效液相色谱（high-performance liquid chromatography,HPLC）。凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱等均为常规色谱法。HPLC包括反相高效液相色谱（reversed-phase HPLC,RP-HPLC）、离子交换高效液相色谱（ion exchange HPLC）等。根据目标蛋白性质的不同可选用相应的色谱分离技术纯化蛋白质。

1.用于蛋白纯化的透析

2.离子交换色谱法

离子交换色谱法（ion exchange chromatography,IEC）是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的不同进行分离的技术，通常包括吸附、吸收、扩散、穿透、静电引力等复杂的物理化学过程。自然界的包括蛋白质在内的生物大分子都带有电荷，当所需分离的物质通过离子交换色谱柱时，由于所带电荷、分子量等不同，有些被固定相靠静电引力所吸附，未被吸附的物质可被缓冲液首先洗脱出来；被吸附的物质由于所带电荷多少不同，对固定相的亲和力大小也不同，可被梯度离子缓冲液先后洗脱下来，使同一溶液中的不同物质被分离。色谱柱中填充的阴离子交换剂可用于带正电荷物质的分离，而阳离子交换剂可用于带负电荷物质的分离。

3.蛋白纯化亲和色谱

许多生物大分子物质具有与其结构相对应的专一分子发生可逆性结合的特征，如酶与底物及辅助因子、酶与抑制剂、抗原与抗体、激素与受体、核酸片段与其互补的核酸序列、生物素与亲合素等，分子间的这种结合能力叫作亲和力。

亲和色谱（affinity chromatography）是利用生物大分子间所具有的特异性亲和能力进行分离的方法。该方法常把可亲和的一对分子中的一方固定在不溶于水的化合物上作为色谱的支持体即载体，使之固相化，作为固定相；另一方随流动相流经固定相，双方即可发生特异性结合；用流动相经过一段时间的洗涤，可将杂质去除，而后再利用亲和吸附的可逆特性，改用特殊的流动相使所需分离的物质被解离下来，从而得到纯化的物质。亲和色谱法中的载体种类很多，最常用的是琼脂糖凝胶（sepharose），其分子上有较多的羟基，活化后可与亲和分子相耦联，另外其理化性质稳定，不会影响色谱的分离过程。

4.HPLC 法蛋白纯化

高效液相色谱法(HPLC)是一种用于分析和分离液体样品的方法。在化学生物学实验室中，HPLC是纯化多肽（人工合成或用合成器自动合成）和其他中小型有机分子不可或缺的过程。它还允许使用颗粒非常小的柱填料，这就给固定相和流经它的分子之间产生相互作用提供了更大的表面积，这样可以更好地分离混合物的成分。

针对特定应用开发的HPLC色谱柱有很多种类，如正相HPLC(NP-HPLC)和反相HPLC(RP-HPLC)。正确选择色谱柱是获得良好的HPLC结果的关键。色谱柱的选择取决于我们希望分离的混合物的组分特性。

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