杂交瘤技术即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。这一技术的基础是细胞融合技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。

杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。

其原理从下列3个主要步骤阐明。

(一)细胞的选择与融合

建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。

使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇(PEG1 000～2 000)是最常用的细胞融合剂，一般应用浓度为40%(W/V)。

(二)选择培养基的应用

细胞融合是一个随机的物理学过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中仅存活5～7d，无需特别筛选；细胞的多聚体形式也容易死去；而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。

细胞DNA合成一般有两条途径。主要途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。细胞融合的选择培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)，所以取三者的字头称为HAT培养基。甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖。

(三)有限稀释与抗原特异性选择

在动物免疫中，应选用高纯度抗原。一种抗原往往有多个决定簇，一个动物体在受到抗原刺激后产生的体液免疫应答实质是众多B细胞群的抗体分泌，而针对目标抗原表位的B细胞只占极少部分。由于细胞融合是一个随机的过程，在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体，需经筛选去除。筛选过程一般分为两步进行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上进行的特异性抗体筛选。将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间(30%的孔为0才能保证每个孔中是单个细胞)，培养后取上清液用ELISA法选出抗体高分泌性的细胞；这一过程常被习惯地称作克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。

杂交瘤技术的应用

①单克隆抗体治疗学

相比于其他生物制品，mAb针对其目标抗原可维持极高的亲和力。由于其高亲和力和特异性，研究人员开始研究mAb作为代谢激活剂、抑制剂和免疫调节剂的治疗潜力。虽然美国FDA批准的最初几种mAb疗法（如莫罗莫那-CD3）仅在小鼠体内产生，很明显的是为了避免免疫排斥，未来，基于mAb的疗法需要进行人源化。自1986年批准莫罗莫那-CD3以来，FDA已经批准了约80种mAb疗法，用于治疗从自身免疫疾病到炎症疾病、HIV和癌症等疾病。有趣的是，尽管1984年发现了组合展示库可作为替代mAb发现平台，但大多数mAb治疗剂最初完全是使用杂交瘤技术在小鼠或人源化小鼠中发现的。这种偏好的原因可能是由于小鼠免疫系统产生高度特异性mAb的自然能力，这些mAb在人源化后引发强大的恒定结构域功能，但其免疫反应性有限。

②体内诊断

体内诊断是临床医生通过分析体内的生物标志物而不是通过实验室内的生物样本来诊断疾病进展的一种非侵入性方法。大多数基于抗体的体内诊断可用于高度特异性成像。一些常见的影像学方法包括正电子发射断层扫描（PET）、磁共振成像（MRI）、荧光分子断层扫描（FMT）和超声。免疫成像和标准成像之间的区别主要在于，标记抗体不是对身体的一大片非特异性区域进行成像，而是针对一个精确的位置进行诊断成像。如果没有基于杂交瘤的抗体发现，这种将全长抗体或抗体片段偶联到纳米颗粒（放射性同位素、荧光团或正电子发射器）上的想法是不可能实现的。通过杂交瘤技术，才发现了在检查过程中不会对病人自身免疫系统产生不利影响的天然mAb可变结构域。

目前义翘神州提供杂交瘤开发平台，整个技术路线涵盖：

1）全面分析目标靶点的特性，制定个性化的动物免疫方案；

2）采用电融合的方式进行杂交瘤细胞融合，并在亚克隆筛选过程中，配合抗体目标质控需求，进行FCM、IHC、WB、中和活性检测等多样化的筛选方案，提高筛选效率；

3）抗体生产过程中，采用无血清细胞培养的方式，减少动物源性污染，具备微克到千克级的抗体生产规模。

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