酵母化学感受态细胞制备试剂盒说明书

发布时间:2017/5/11 21:35:00

本酵母化学感受态细胞制备试剂是一种通过化学处理,高效快速制备酿酒酵母化学感受态细胞,用于长期冻存以备后续转化的产品,它具有下列特点:

1. 制备,-80℃保存,多次使用,免去每次转化都要制备酿酒酵母感受态细胞。

2. 操作简单,单溶液制备,除酵母培养的时间外,整个操作只需要30 分钟3. 主要用于酿酒酵母S. cerevisiae,也适用于其他多种实验用酵母菌株,包括S. pombe、C. albicans、Pichia pastoris 等。

4. 受体酵母可以不含质粒,也可用于携带有选择性质粒的酵母(如双杂交体系中的酵母)。

5. 对酿酒酵母,转化效率可达到0.2-1×105 个转化子/ug 质粒DNA。对其他酵母,效率稍低,范围在100-2000 个转化子/ug 质粒DNA。

6. 得到的感受态细胞可以用各种线性或环状酵母穿梭质粒DNA 进行转化,例如YIp, YRp, YCp, YEp 和YAC 等。

7. 可以用于酵母双杂交、定点突变(Site-Directed Mutagenesis)、基因破坏(Gene Disruption)、等位突变基因修复(Mutant Allele Recovery)等实验。

8. 本产品可以制备20 只酵母感受态细胞(需要200mL 酵母培养液),其中A型只用于制备感受态细胞,B 型还带高效转化液。

常温运输和保存,有效期一年。

使用方法:

一:酵母化学感受态细胞的制备

说明:按本方法制备1 管酵母化学感受态细胞就需要OD600 达到0.6-1.0 的新鲜酵母培养液10 mL,用户需根据所需酵母感受态细胞的数量决定培养细胞的体积。如果超过10 mL,则制备液的使用量需要按比例增加。

1. 挑取酵母受体菌的新鲜的单菌落(4℃放置不超过3 周的也可以),接种到装在50mL 离心管中的10 mL 的自备的YPD 培养基中。

2. 30℃摇晃培养,摇床速度250 rpm/分钟,直到OD600 达到0.6-1.0(相当于0.6-1×107 细胞/mL)。

3. 室温3000rpm 离心5 min,弃上清得酵母细胞沉淀。

4. 新鲜制备适量的酵母感受态制备工作液。对10 mL 酵母需要5.25 mL的工作液,其配制方法是:将4.75 mL 制备液A、0.25 mL 制备液B和0.25 mL 制备液C 加入到一个无菌的离心管中后充分震荡混匀即可。

酵母感受态制备工作液可放室温待用。

5. 用0.5 倍体积的新鲜配制的酵母感受态制备工作液洗涤酵母细胞沉淀(对10 mL 酵母则需要5 mL 酵母感受态制备工作液)。即混合后振荡1 分钟,室温3000rpm 离心3 分钟,去上清得洗涤后的酵母细胞

沉淀。

6. 再用0.02 倍体积的酵母感受态制备工作液充分重悬菌体(对10 mL酵母,则需要0.2 mL 酵母感受态制备工作液)。

7. 按每管0.2 mL 分装到冷冻管中,放入保温冰盒中冷却半小时后再放入-80℃冰箱待用。0.2 mL 的感受态细胞足够1 次转化使用。注意:放入保温冰盒的目的是使温度缓慢下降,急冻将使转化效率降低,这点跟大肠杆菌感受态制备过程不同。

二:化学转化酵母感受态细胞(只有B 型提供相关试剂)

1. 将总体积不超过20 uL 的0.1-5 ug 质粒DNA 加到刚从-80℃冰箱取出的、还处于凝固状态的0.2 mL 酵母感受态细胞上。注意:同时做一个不加质粒DNA 的阴性对照组。

2. 室温充分振荡直到凝固的感受态细胞完全融化。注意:此步非常关键,如果能在恒温振荡器上37℃振荡5 分钟,则效果更好。

3. 加入1.4mL 转化液A,轻柔颠倒混匀一分钟。

4. 30℃培养1 小时。

5. 室温3000g 离心5 秒,弃上清。

6. 在酵母细胞沉淀中加1.0 mL 转化液B,振荡一分钟。

7. 室温3000g 离心5 秒,弃上清。

8. 在酵母沉淀细胞中加入适量(如100 uL)的转化液B,混匀后在在选择培养基上全部涂盘。

9. 30℃培养3-5 天后即得酵母转化菌落。