重组蛋白N 端的GST 谷胱甘肽S 转移酶（Glutathione S Transferase）能提高重组蛋白的水溶性，所以常用于蛋白质重组表达。GST-谷胱甘肽亲和层析是利用GST 标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合，并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立，是目前分离纯化GST 标记蛋白质的重要方法。本产品就是专门用于上述目的，具有下列特点：

1. 一站式套装，含所需的谷胱甘肽介质、溶液和层析柱，用户只需要提供表达GST 标记蛋白的细菌（酵母、杆状病毒、培养细胞）即可，非常方便。

2. 专一性强，过柱即可获得纯度高达95%的GST-标记蛋白。

3. 只能在非变性条件下使用，只可用于纯化没形成包涵体的GST 标记蛋白。

4. 每次可以处理20 mL 的表达菌液，适合初步筛选和鉴定。

5. 提供4 mL 浓度为50%的谷胱甘肽-Agarose 介质，可吸附5-10 mgGST 标记蛋白质。

6. 本介质可以反复使用多次。

常温运输和保存，溶菌酶、Benzonase 和PMSF 需低温运输。收到货后，介质需4℃保存，溶菌酶、Benzonase 和PMSF 需-20℃保存，有效期一年

使用方法：

注意：

1. 每步得到的样品都留存少量作为SDS-PAGE 分析的对照，在下面描述中就不再提醒。

2. 本实验需要用到的1×PBS 缓冲液可用自备的超纯水稀释本试剂盒提供的10×PBS 缓冲液而得。PBS 缓冲液用超纯水稀释后极其容易长细菌，注意防止污染。

3. GST 洗脱液的配制方法是将约80mg GST 洗脱液成分二干粉全部加入到GST 洗脱液成分一溶液中，摇晃直到干粉全部溶解即得GST 洗脱液，分装成小份放-20℃保存，每次用一管。

一:重组蛋白的表达和细菌收集

1. 37℃振荡培养20 mL 含表达质粒的细菌到OD600=0.6-0.8。

2. 加IPTG 到终浓度为0.1 mM，30℃振荡培养3 小时或22℃振荡培养8小时（或过夜）。

3. 4℃ 5000 g 离心10 分钟收集20 mL 表达菌液，弃上清。

4. 用1×PBS 缓冲液重悬细菌沉淀，4℃ 5000 g 离心10 分钟，弃上清。

沉淀可直接用于裂解或放-80℃保存。

二：细胞裂解

5. 如果用本产品A 型，用1 mL 冰浴的新鲜配制的细胞裂解液（1 mL 1×PBS 缓冲液+50 uL 溶液A+ 25 uL 10 mg/mL 的PMSF 溶液）重悬细菌沉淀，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，一般选1K-10K 频率处理15 次，每次20 秒，间隔1 分钟（必需放置在冰上）。裂解物不能粘稠，否则会堵塞层析柱。

6. 如果用本产品B 型，在1 mL 冰浴的新鲜配制的细胞裂解液（在20 mL1×PBS 缓冲液中加入所有30 mg 溶菌酶干粉，溶解后分装成1 mL/管，取一管使用，剩余的-20℃放置）中加入25 uL 10 mg/mL 的PMSF 溶

液和1 uL Benzonase，用此混合液重悬细菌沉淀后冰上放置30 分钟，得到细菌裂解物。

7. 将超声或酶法细胞裂解物在13000 g 4℃离心10 分钟去除未裂解细胞和裂解细胞碎片以防堵柱，所得上清即含可溶性GST 标记蛋白。

三：层析柱的制备和GST 蛋白纯化

8. 摇晃将谷胱甘肽-Agarose 介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中（介质用量需要根据GST 蛋白产量决定，100 mL 菌液一般使用200 uL 介质即可）。下列步骤各溶液的用量均针对200 uL 介质而定，如果介质用量不同，各溶液用量需相应调整。

9. 用5 mL 预冷的1×PBS 缓冲液洗柱。

10. 将第7 步得到的上清液（含可溶性GST 标记蛋白）上柱，让重力使上柱液自然流出，收集并保存穿透液用于SDS-PAGE 电泳。GST 和谷胱甘肽之间的结合很缓慢，所以流速一定不能快，否则结合不充分。流速一般在0.2-1 mL/分钟即可。如要提高GST 标记蛋白与介质的结合效率，可用本试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在4℃结合30 分钟或过夜。也可以将穿透液反复上柱。

11. 用0.5-2 mL 1×PBS 缓冲液洗柱，收集并保存穿透液（含杂蛋白）。

12. 用0.2-1 mL GST 洗脱液洗柱，收集并保存穿透液（含GST 标记蛋白）。

由于可能含蛋白酶污染，所以穿透液不能在4℃放置，需立即用于后续处理（如浓度测定或SDS-PAGE 电泳）或-80℃长期放置。

13. 对收集的2 种穿透液和洗脱液进行蛋白定量或SDS-PAGE 分析。注意：如果不预先脱盐，则只能用Bradford 法或OD 检测法（1 OD280 约等于0.5 mg/mL 蛋白）测定穿透液和洗脱液的蛋白浓度。由于GST 的分子量为26 KD，所以在SDS-PAGE 胶上，GST 标记蛋白将比天然蛋白大26 KD。

附：GST 柱的恢复（本试剂盒不含所需试剂）

1. 用3 倍体积的6 M 盐酸胍处理柱子10 分钟。

2. 用3 倍体积的超纯水处理柱子10 分钟。

3. 用3 倍体积的缓冲液一（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 8.5）处理柱子10 分钟。

4. 用3 倍体积的缓冲液二（0.5 M NaCl，0.1 M TrisHCl，pH 4.5）处理柱子10 分钟。

5. 再重复3-4 步两次。

6. 用3 倍体积的超纯水处理柱子3 次。

7. 用3 倍体积的1×PBS 缓冲液处理柱子2 次。

8. 堵上漏口，加3 倍体积的1×PBS 缓冲液待用。若长时间不用，则第7步和第8 步的1×PBS 改成20%的乙醇。