本产品是基于PCR的甲基化DNA检测试剂盒（即MSP试剂盒）。它由两个成分组成，一个是亚硫酸氢盐试剂盒，用于将DNA中所有没有甲基化的C转化成U，而甲基化的C不变。二是优化的PCR试剂盒，利用客户自备的专一性引物，根据PCR来检测甲基化位点的位置。本产品的特点如下:

1． 本产品是亚硫酸盐修饰试剂盒和即用型PCR 3.0的整合，即开即用，非常方便。

2． 柱式DNA回收方法极大提高亚硫酸盐修饰后DNA的回收率。

3． 优化的PCR mix，含有PCR所需要的所有成分，减少了操作误差。

4． PCR结束后可以直接上样电泳，非常方便。

5． 用户需要自备MSP专一性引物。

常温运输和保存（PCR MagicMix 3.0要低温运输，-20℃保存），有效期一年。

使用方法：

（一）亚硫酸氢盐修饰

一：准备试剂

1. 配制溶液B成分一溶液：加5.0 mL 超纯水和27 uL溶液A到装有溶液B成分一干粉的棕色塑料瓶中，轻柔摇晃至溶（尽量少的剧烈摇晃，约需要5分钟），总体积约5.5 mL。

2. 配制溶液B成分二溶液：加10mL超纯水到装有溶液B成分二干粉的棕色塑料瓶中，轻柔摇晃混匀（尽量少的剧烈摇晃）。

3. 配制溶液B工作液：将55 uL 溶液B成分二溶液加入到溶液B成分一溶液中，轻柔颠倒混匀即可使用。一瓶溶液B工作液可以用10次。

二：DNA变性处理

1. 将5 uL 溶液A加入到45 uL DNA溶液中并吹打混匀（总体积没有45 uL需要用水补足到45 uL，DNA总量在0.2-5 ug之间，不能超过 5 ug，一般使用2 ug DNA即可）。 注意：DNA必须是线状的，长度在20-50 Kb左右。基因组DNA可以预先用酶切处理（酶的位点不得在研究的DNA序列之内），也可以用机械打断法处理（得到的DNA一般在20-50 Kb左右）。

2. 37℃放置15分钟使DNA充分变性。

3. 立即在DNA溶液中加入500 uL溶液B工作液，轻柔颠倒混匀。

4. 55℃避光保温8-16小时。如果使用水浴或没有热盖的PCR仪器保温，加50-100uL石蜡油，避免水分蒸发。

注意：必须避光保温。55℃处理8小时足以使95%的C变成U，保温时间过长会引起DNA的断裂。如果有的区域的C难以转化成U，可以改用两步式PCR处理（每55℃保温3小时后95℃变性处理5分钟，共5-10个循环），效果会更佳。

5. 冰浴10分钟。

6. 加入1 mL的通用溶胶液，颠倒混匀后取一半溶液上柱。单链DNA会结合在离心吸附柱上，亚硫酸氢盐等将穿透过柱。

7. 12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。

8. 取另一半溶液再上柱，12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。单链DNA会结合在离心吸附柱上，亚硫酸氢盐等将穿透过柱。

9. 加入0.7 mL通用洗柱液，12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。此步可以洗涤残留的亚硫酸氢盐。

10. 干甩半分钟后，将离心吸附柱转移到一个新的离心管中，加入50 uL新鲜配制的溶液A稀释液（5 uL的溶液A原液与45 uL的超纯水混合而得），室温放置2分钟后离心半分钟。

11. 将洗脱下来的DNA溶液放置在37℃保温15分钟。

12. 加入0.7 mL的通用溶胶液，混匀后上柱。

13.12,000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。单链DNA会结合在离心吸附柱上，杂质等将穿透过柱。

14. 干甩半分钟后，将离心吸附柱转移到一个新的离心管中，加入50 uL DNA洗脱液，室温放置2分钟后离心半分钟。

15. 所得溶液即为亚硫酸氢盐修饰的DNA，可以用于下面的甲基化专一PCR。

说明：此方法的回收率一般为50%，2ug DNA可以得到1 ug的修饰后的DNA。由于修饰后的DNA呈长短不一的单链，EB染色效果很差，所以不能用灵敏度低的琼脂糖电泳-EB染色的方法检测，但可以用灵敏度更高的PAGE-银染方法检测。