本产品专门用于从常见的各种真菌中快速提取总 RNA，然后再用（dT）纤 维素分离其中的 mRNA，提取过的真菌包括 Candida albican，Saccharomyces cerevisiae，Schizosaccharomyces pombe 和 Pichia pastoris、Aspergillus flavus 等。本产品的特点是：

1. 一站式操作，本试剂盒足够 50 次微量真菌总 RNA 提取，25 次微量 mRNA 提取。

2. 得到的 mRNA 可直接用于 RT-PCR、Northern 杂交、microarray hybridization、cDNA 合成等。

3. 操作比柱式法 mRNA 纯化法更简单，不需要过柱，免去很多繁琐步骤。

4. 整个过程只需要约 60 分钟。

低温运输， Oligo(dT)纤维素-20℃保存，其余产品可以室温放置。本产品有效期一年。

使用方法：

一：用真菌 RNAout 提取总 RNA

1. 将 50 mg 左右的干菌丝(或 100 mg 左右的鲜菌丝、或适当数量的真菌菌落)转移到 1.5 mL 塑料离心管中。如果是液体真菌培养物，则直接将 1-10 mL 液体真菌在 1.5 mL 塑料离心管中 12000-15000 g 离心 1 分钟，并弃尽液 体培养基（可以分多次离心）。

2. 加入 0.4 mL 溶液 A 并充分吹打混匀。如果 A 溶液存放时产生沉淀，请置于65℃融化，用前充分摇晃均匀。

3. 加入 0.4 mL 溶液 B，剧烈振荡 30 秒。

4. 65℃保温 5 分钟。

5. 室温 12000-15000 g 离心 3-5 分钟，转移上清到一干净的 1.5 mL 塑料离心管中.

6. 再加入 0.1 mL 溶液 B 和 0.1 mL 自备氯仿，振荡混匀 30 秒。

7. 室温 12000-15000 g 离心 3-5 分钟，转移上清到一干净的 1.5 mL 塑料离 心管中。

8. 加入两倍体积（约 0.8-1 mL）的溶液 C，充分混匀。

9. 室温 12000-15000 g 离心离心 3-10 分钟，RNA 将在管底形成沉淀，小心 弃上清。

10. 加自备的 75%乙醇，振荡器上振荡混均 30 秒。

11. 室温 12000-15000 g 离心 1 分钟。

12. 小心吸弃上清液，注意不要吸弃 RNA 沉淀。

13. 重复 75%乙醇洗涤步骤。

14. 短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留液（约 50 uL）。

15. 短暂放 1-2 分钟后加入 50 uL RNA-free 水使 RNA 沉淀溶解，可以立即用 于 mRNA 纯化或存放于-80℃长期保存。

二：从真菌总 RNA 中提取真菌 mRNA

本产品提供本产品提供 25 mg Oligo(dT)纤维素，每克 Oligo(dT)纤维素能够结合 50-80 OD 的 mRNA。

1. 在一个 1.5 mL 塑料离心管中称取 1 mg Oligo (dT)纤维素。将 0.5 mL 结

合液加入到一管装有 1 mg Oligo (dT)纤维素的离心管中，混匀后室温放置 5 分钟。也可以将 250 uL 结合液加入到装有 25 mg Oligo(dT)纤维素的离心 管中，每次取 10 uL（相当于 1 mg Oligo (dT)纤维素）与 0.5 mL 结合液 混匀，室温放置 5 分钟。剩余部分放-80℃保存。

2. 200-2000 g 离心 30 秒，小心吸弃上清后留 Oligo (dT)纤维素沉淀待用。

3. 将在节中提取的两管相同的总 RNA（每个样品用 50 uL）混合在一起得 到总 RNA 100 uL，65℃加热 5 分钟。也可以只用一管总 RNA，但需要补 水到 100 uL，再 65℃加热 5 分钟。

4. 加入等体积的结合液，混匀后冷却到室温后，全部转移到装有 Oligo(dT)纤 维素的离心管中，

5. 混匀后室温放置 5 分钟，期间颠倒混匀数次。

6. 4℃ 200-2000g 离心 5 分钟，小心将上清转移到一个离心管中。此上清液 是去除了 mRNA 的总 RNA。冰上放置待用。

7. 加入 0.5 mL 结合液，混匀后 4℃ 200-2000g 离心 5 分钟，小心弃上清。

8. 重复上步 2-4 次。

9. 加入 50 uL RNase-free 水，混匀后 4℃ 200-2000g 离心 5 分钟，小心收 集上清（mRNA）。

10. 重复上步 1-3 次。

11. 将各次收集的 mRNA 混合用于下步的核酸沉淀。

三：用微量核酸沉淀剂沉淀 mRNA

1. 按 2:1 的比例将微量核酸沉淀剂与 mRNA 溶液混合。微量核酸沉淀剂用前 需要摇匀。

2. 室温 15000 g 离心 10 分钟(如果 mRNA 含量在 2 ng 以下，建议离心 30 分钟)。

3. 小心弃上清后，加入 1 mL 自备的 75%乙醇，振荡混匀。

4. 15000 离心 3-5 分钟，小心弃上清。

5. 再短暂离心后小心吸弃上清， 沉淀即为回收的 mRNA 沉淀， 可溶于 RNase-free 水中待用。