分枝杆菌属（Mycobacterium）是极为古老的细菌，与人类的疾病相关的就有25种以上，包括引起结核病的结核分枝杆菌（Mycobacteria tuberculosis）。近年来由于多重耐药性分枝杆菌的出现，分枝杆菌再次成为人们关心的细菌。PCR快速诊断是目前检测分枝杆菌的主流方法，但由于此类细菌具有十分独特的坚硬的细胞壁，快速提取其基因组DNA一直是十分棘手的技术问题。本产品就是为解决这一问题而开发，具有下列特点：

1. 每克分枝杆菌湿重可以提取到3-4mg基因组DNA。

2. 操作简单，整个过程约60分钟左右，容易放量操作。

3. 适用于培养的分枝杆菌，也适用于含分枝杆菌的痰液等样品。

4. 价廉物美，与国外同类产品相比质量相当，但价格便宜。

常温运输及保存、有效期一年。

注意：文献报道部分分枝杆菌在DNA提取过程中还有形成菌落的能力，所以任何丢弃的溶液都必须按有传染性的污染物品对待，并严格按有关部门要求进行消毒处理。

一: 如果细菌来于痰液样品，则按下面方法进行预处理（本试剂盒不提供所需试剂，操作步骤仅供参考）

1. 用痰液收集器收集约5 mL患者深咳痰并转移到15 mL塑料离心管中。

2. 加入等量的化痰液（2% NaOH、1.45%柠檬酸钠、0.5% N-乙酰-L-半胱氨酸），震荡使二者充分混匀。37℃放置25-40分钟。此步处理可以使粘稠的痰液便于操作，同时可以裂解不属于分枝杆菌的杂菌，只有分枝杆菌保持完整。

3. 5000 g离心5分钟，弃上清液。分枝杆菌将沉淀在管底，可以直接用于DNA提取。也可以保存在-20℃待用。

二: 如果分枝杆菌来于培养的菌落，则按下面方法进行预处理

1. 刮取培养的菌苔到1 mL TE缓冲液中（装在1.5mL塑料离心管中）并充分震荡使细菌均匀重悬。如果是培养的液体菌液或其他液体样品材料，则取1mL菌液到1.5 mL塑料离心管中。提取所需细菌用量为109 CFU左右

2. 80℃加热20分钟杀灭分枝杆菌使之失去传染性。

4. 常温5000 g离心5分钟，弃上清液。分枝杆菌将沉淀在管底，可以直接用于DNA提取。也可以保存在-20℃待用。

三: 分枝杆菌基因组DNA提取

1. 将150 uL 65℃预热过的溶液A加到上步得到的、有分枝杆菌沉淀的塑料离心管中，充分震荡使细菌均匀悬浮。

2. 再加入300 uL 溶液B（呈乳浊状）和300 uL 自备氯仿，充分震荡混匀。

3. 将混合液-20℃放置直到液体凝固，一般需要20-60分钟。一定要凝固后才能进入下一步。

4. 将样品管放室温融化后，12000-15000 g室温离心5分钟，小心转移上清到一新的离心管中。

5. 在上清液中加两倍体积的无水乙醇，颠倒混匀后12000-15000 g室温离心10分钟，小心弃上清。DNA将形成沉淀，不要丢失。

6. 在离心管中加1 mL 自备70%乙醇，短暂震荡，12000-15000 g室温离心3分钟，弃上清。此步洗涤残留盐离子等杂质。

7. 重复上述操作。

8. 短暂离心离心管，小心吸弃残留的液体（约50 μL）。此步不要省略，否则残留的液体（含乙醇）将会影响DNA电泳、酶切和PCR等反应。

9. 立即加入50-100 μL TE缓冲液充分溶解DNA沉淀。

10. 直接取5-10 uL电泳检测DNA，其余放冰箱备用或用于后续反应。