本产品是包涵体微量纯化试剂盒（BTN??90508）的大提升级产品，用于大量，快速的提取高质量的包涵体。它具有下列特点：

1. 大量提取，1次可处理多达5升的菌液，相当于50次中量提取。

2. 适合制备级别的包涵体纯化，需在50 mL以上的离心管或离心瓶中完成。

3. 能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白在包涵体中所占比重达到60%以上。

4. 即可以选择高压裂解法，也可以采用酶学裂解法裂解细菌。

5. 得到的包涵体可以用于重折叠，也可以用于凝胶层析和动物免疫。

常温运输，4℃保存（溶菌酶需要-20℃保存，包涵体溶解液可以室温保存），有效期一年。

使用方法：

一． 细胞沉淀：

1. 转移1-5升菌液到干净的、预称重量的塑料离心瓶中。如果离心瓶体积不够大，可以分多次反复离心收集。

2. 5,000 g （相当于Sorvall GSA转头5500 rpm） 4℃离心15-30分钟，小心弃上清。

3. 复称重量，差值就是细菌的湿重。1升的过夜培养的大肠杆菌湿重一般为3克，所以1-5升菌液一般能得到3-15克细菌。注意：后续操作的很多溶液都是按此步得到得细胞湿重添加。

4. 细胞沉淀可以立即使用或存放在-80℃待用。

二． 细胞裂解(下面两法中选其一)：

高压破碎法（French Press）+超声法（推荐方法）

1. 按每克细菌湿重加入3 mL溶液A重悬细胞，可以用玻璃棒搅拌或用Waring捣碎机匀浆（如果细菌湿重超过10克）使细菌悬浮，直到检测不到成块的细

胞为止。如有必要，可以加入溶菌酶干粉，使其终浓度为0.2mg/mL。

2. 让细胞通过压力为16000-18000 lb/in2的高压细胞破碎仪，收集的细胞裂解液需放冰上。

3. 重复上步操作或多次，直到绝大部分细菌都被裂解。注意：每次处理后在显微镜下检查细菌裂解的比例。

4. 将细胞裂解液置于冰浴中，用超声破碎仪满功率下超声处理5分钟，工作状态为50%（开0.5秒，关0.5秒）。此过程中将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌，否则产生的热量会使包涵体蛋白变性，在纯化中丢失。

酶法+超声法（在没有高压破碎仪器时方法）

1. 按每克细菌湿重加入3 mL的含溶菌酶的溶液A重悬细胞，可以用玻璃棒搅拌细菌沉淀使之悬浮。

2. 在细菌悬浮液中加入溶菌酶干粉，使其终浓度为0.2mg/mL，搅拌混匀后37℃放置30分钟裂解细菌，其间不时需要用玻璃棒混匀。细菌释放出的DNA将使裂解物变得十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要继续裂解，否则完整细菌将和包涵体一起沉淀，影响包涵体的纯度。由于处理量大，在显微镜下检查细菌是否充分裂解。

3. 将细胞裂解液置于冰浴中，用超声破碎仪满功率下超声处理5分钟，工作状态为50%（开0.5秒，关0.5秒）。此过程中将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌，否则产生的热量会使包涵体蛋白变性，在纯化中丢失。

三． 包涵体纯化：

1. 将超声处理的细胞裂解液转移到离心瓶中，22，000g 4℃下高速离心60分钟（注意：转子不同其对应的离心速度不同），小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重组蛋白，可以保留作为SDS-PAGE对照样品。

2. 将沉淀（主要由包涵体构成）悬浮在预冷的溶液B中。每克细菌需要5 mL溶液B，1升细菌的湿重约3克，大约需要15 mL溶液B，用玻璃棒或匀浆器搅拌混匀后室温放置5分钟。

3. 22，000g 4℃下高速离心30分钟，沉淀将出现三层，最下面的是未彻底破裂的细胞碎片，其上是包涵体，最上层的松软沉淀是细胞壁和细胞外膜。如果处理过程中使用过溶菌酶，则此层较薄。小心收集上清，可以作为包涵体次洗涤的对照样品。

4. 重复第8-第9步直到上清变清和最上层细胞壁和细胞外膜松软沉淀消失，此过程一般需要重复洗涤2次（共3次洗涤），小心收集上清作为包涵体第二次洗涤和第三次洗涤的对照样品。本试剂盒提供的溶液B足够5升规模的提取洗3次，如需更多溶液B请单独购买。

5. 上步得到的沉淀即为包涵体，其中重组蛋白一般占60%重量，其余40%为其他蛋白质。此沉淀可以长期放置在-80℃冰箱待用，也可以直接用于免疫动物制备抗体，还可以直接进入下面得包涵体的溶解步骤。

6. 估计重组蛋白的产率：首先需要通过预实验知道重组蛋白的表达水品，如果表达水平为1%，则1克湿重的细菌中将含有1 mg重组蛋白质。此法得到的重组蛋白质的回收率一般在75%，即1mg重组蛋白质能得到0.75 mg，丢失0.25mg。

四．包涵体的溶解：

1. 在室温下，将包涵体溶解液加入到包涵体沉淀中，用枪头充分吹打后漩涡震荡。如果需要将溶解的包涵体直接用于凝胶过滤层析进一步纯化，则按每克原始细胞湿重加入1 mL包涵体溶解液，重组蛋白的浓度约为4-5 mg/mL；如果需要将溶解的包涵体直接用于蛋白质折叠，则按每克原始细胞湿重加入3 mL包涵体溶解液, 重组蛋白的浓度约为1-2 mg/mL；注意：包涵体溶解液低温放置会产生沉淀，必须45-65℃溶化并混匀后才能使用。

2. 室温放置1小时使蛋白质充分溶解。

3. 100,000g 4℃离心60分钟(转速需要根据离心机转子的大小换算)，小心收集上清，保留不溶性沉淀。注意：检查离心管能否承受此离心力。SDS-PAGE检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完全溶解，需要用适当增加包涵体溶解液的用量。

4. 将上清（溶解的包涵体）分成10-20mL一份，放于塑料离心管中（不要超过离心管容量的70%）置-80℃长期保存或直接用于复性等试验。由于不同的蛋白质有不同的复性条件，需要用户自己摸索。包涵体纯化过程中引入了溶菌酶，在SDS-PAGE分析时可能有额外条带出现。