产品特点：

一个哺乳动物单细胞一般只有约10pg 的总RNA，其中的mRNA 只有1-5%(约10E5-10E6 个分子),因此直接用单细胞进行mRNA 扩增具有极大的技术难度。本公司进过精心研究，整合技术，开发出了可以直接用单

个细胞进行mRNA 扩增的试剂盒本产品具有下列特点：

1. 双向，既可用于制备正义的mRNA，也可用于制备反义的aRNA（antisense RNA）或cRNA（complimenary RNA）。

2. 直接用单细胞裂解液进行反应，免RNA 提取，整个过程只需要半天。

3. 适用于多种单细胞，包括卵细胞、干细胞、FACS 分离细胞等单细胞，还可用于培养细胞和胚胎等实体租组织（需要单细胞化），也可以使用10pg-10ng 纯化的总RNA 作为模板。

4. 假阴性和假阳性率均小于6%，RNA 扩增成功率为90%。

5. 所得mRNA 或aRNA（cRNA）可以直接用于后续的RT-PCR、芯片杂交、表达谱分析等实验。

6. 本试剂盒足够对80 个单细胞进行单细胞RNA 扩增。

低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

强烈建议首次使用本产品前，先预实验，用纯化好的任何总RNA 10 倍系列稀释，直到浓度为25pg/uL，然后用0.4 uL（即10pg RNA，相当于单个细胞的总RNA 量）按本操作手册进行扩增，需平行做4-10 个重复。

下列步骤仅用于制备mRNA，如果需要制备aRNA（cRNA），则需要把P1 和P2 引物对换，其他成分不需要做任何改动。

一：新鲜准备工作液

见手册左侧各表，据此配制的的各工作液足够扩增10 个单细胞用。如果实验没有10 个细胞，工作液的量仍需按10 个细胞的用量新鲜配制，冰上放置时间不能超过1 小时。

二：准备单细胞悬液

如何制备单个细胞取决于实验样品和所能使用的仪器设备，此处所列步骤仅供作为分离单个培养细胞的参考，本试剂盒不提供相关试剂。对其他材料（如干细胞克隆、2-8 细胞胚胎、胚囊、胚胎组织等）用户需自行选用合适的制备单细胞的方法。对已经处于单细胞悬浮状态的细胞（如FACS 分离细胞、卵细胞等），则可以跳过此步直接进入第下步操作)：

1. 按常规胰酶方法处理培养细胞或组织，将细胞重悬于培养基中并计数。

2. 转移100-4000 个细胞到离心管中，400g 离心4 分钟，弃上清。

3. 将细胞沉淀重悬于50uL 自备PBS 中，使其终浓度为2-80 个细胞/uL，所得细胞悬液可直接用于下面的反应。本方法一个管中可以处理1-40 个细胞，但这些细胞必须是先分离成独立细胞的，不能是未分离的细胞团。

三：cDNA 合成和PCR 扩增

4. 标记10 个0.5 mL PCR 管（10 号设为阴性对照）

5. 将模板来于一个样的2 管PCR 产物汇集，20 管汇集后将得10 管（对应于10 个样），每管30uL。只有循环数在24 次以上时电泳才能检测到PCR 产物，故此步不需要电泳检测。

6. 用自备的PCR 产物纯化回收试剂盒回收PCR 产物，去除残留的引物，50 uL 洗脱DNA，产物放-80C 长期保存。

7. 10 个样和其对应的未PCR 对照（共20 个样）各取0.5uL 为模板进行PCR 或定量PCR 分析，判断靶基因在哪个样品中得到了扩增和扩增效率如何。没有靶基因的可以选择看家基因。客户需自备相关引物和试剂。

四：制备含T7 启动子的模板（下列操作只针对10 个样品中的一个）

8. 选一个靶基因得到扩增的DNA 样品（第6 步回收所得），各取1 uL 加到10 个PCR 管中，各加29 uL 新鲜配制的PCR Mix（按左表5 配），混匀后按以下参数扩增1 次（95℃ 5m30s，64℃ 1m，72℃ 5m18s），

再按以下参数扩增8 次（95℃ 30 秒，67℃ 1m，72℃ 5m18s，每次循环后将72℃延伸时间增加6 秒），PCR 结束后在72℃保温10m。

9. 汇集10 管PCR 反应液（共300 uL），用自备的PCR 产物纯化回收试剂盒回收PCR 产物，30 uL 洗脱。

10. 将30 uL 洗脱的DNA 全部上样到琼脂糖胶上进行电泳（只需要电泳10分钟即可，否则胶体积太大，回收效率低），360nm 紫外灯下切胶（250bp以上区域），用30-50uL 洗脱。此步所得PCR 片段无250bp 以下的非特异扩增产物，可以直接用于后续的体外转录。

五：T7 体外转录：请按该试剂盒的使用手册操作（本产品含体外转录试剂）。