产品特点：

线粒体是非常重要的细胞器，它不但跟很多人类疾病相关，而且还是母系遗传研究的重要材料。对线粒体进行遗传研究和进化研究都需要纯化线粒体DNA。本产品就是基于先纯化动物细胞线粒体、再从中柱式法纯化其DNA的两步法试剂盒。它具有下列特点：

1. 即开即用，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。

2. 两步法，先纯化线粒体，再柱式法纯化其中的DNA，有粗提（mtDNA纯化前不用DNase处理线粒体）和精提（mtDNA纯化前用DNase处理线粒体）两套操作方案，适合于各种要求不同的后续实验。

3. 本产品可以处理约107×108个培养细胞，10 mg培养细胞（相当于5瓶150 mm培养细胞）可以纯化到到0.2-0.5 mg线粒体。

4. 本产品适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不建议用于动物实体组织。

5. 提供线粒体染液，可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。

常温运输和保存, 保存期限一年。

使用方法：

注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或冷室进行，所要用到的溶液和离心管都必须预先冷却，否则线粒体容易破裂。

一：线粒体粗提

1. 称25.4g蔗糖到225 mL溶液A中，盖上盖子后充分摇晃3-5分钟溶解即得250 mL溶液A工作液，放冰上预冷待用。未用完的溶液A工作液需要-20℃保存，否则会长菌。

2. 如果是单层细胞，先用20 mL PBS缓冲液洗涤107×108个培养的单层细胞，共洗涤2次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在20 mL PBS缓冲液中。如果是悬浮细胞，则1000g 4℃离心10分钟收集107×108个细胞，再用20 mL PBS缓冲液洗涤2次，将细胞重悬在20 mL PBS缓冲液中。

3. 用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机1000 g 4℃离心10分钟，吸弃上清，保留细胞沉淀。

4. 加入5倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的溶液A工作液，轻柔重悬细胞。

5. 如果是成纤维细胞，由于其难于裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置20-30分钟后再化冻，然后进入下步操作。如果不是，则直接进入下步操作。

6. 将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce玻璃匀浆器中（工作体积为10-15 mL，间隙为0.12 mm，是玻璃材质，否则线粒体产率会降低）匀浆适当次数。细胞株不同，其最适匀浆次数不同，一般需要40次-60次左右。匀浆是线粒体纯化最关键的步骤，故匀浆前先通过预实验确定最适匀浆次数，方法是每匀浆5-10次后，取2-3 uL匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到20-50%以下为佳。

7. 用平甩转子离心机4℃ 1000 g离心10分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核，上清液含线粒体。

8. 转移上清液到离心管中，冰上放置待用。如有必要，可在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴一滴上清液到载玻片上，再滴入50 uL詹纳斯染液染色20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。

9. 用固定角度转子（fixed-angle rotor）离心机4℃ 10000 g离心10分钟，弃上清，所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。

10. 用5 mL溶液A工作液洗涤2次得线粒体粗提液（即重悬后，4℃ 10000 g离心10分钟，弃上清）。

11. 如果后续实验是提取mtDNA用于PCR或Southern杂交，则直接进入第3部分mtDNA提取，也可以放-80℃长期保存待用。

12. 如果后续实验是提取mtDNA用于高通量测序，则必须彻底降解掉其中的细胞核DNA污染。匀浆过程中一个破裂的细胞核释放出的DNA相当于上百万个线粒体的DNA量之合，所以无论如何小心，粗提线粒体中必有大量的细胞核DNA污染，如果不将其清除，高通量测得的序列将绝大部分来于核DNA而非mtDNA。

二：线粒体粗提液中细胞核DNA的去除及鉴定

13. 将线粒体重悬于0.3 mL溶液A工作液中，取10 uL作为未处理对照。

14. 加入6 uL Benzonase（1U/uL）溶液和30 uL DNase A溶液（配法：将0.5 mL溶液B加到装有1 mg DNase A干粉的离心管中得到2 mg/mL溶液，未用完的部分需要分装后放-20℃保存）。

15. 37℃保温一段时间酶切细胞核DNA。注意：先预实验，每隔一段时间取10 uL样品，灭活其中的DNase后作为模板用PCR扩增1-4个自选的VNTR位点和1-2个mtDNA基因（如vis或COII基因），检测不到VNTR基因而能检测到mtDNA基因的处理时间为。可从本公司另购细胞核基因和线粒体基因专一性引物。

16. 加入10 uL 自备的0.5M EDTA溶液（pH 8.0）以终止酶反应。显微镜下检查线粒体完整性（见上节第8步）。

17. 用固定角度转子离心机4℃10000 g离心10分钟，弃上清。

18. 用1 mL的溶液A工作液洗涤沉淀（即重悬后，4℃ 10000 g离心10分钟，弃上清。此为洗涤。）2次得到线粒体沉淀。

三：线粒体DNA提取

19. 在不超过100 uL的线粒体沉淀中加入600 uL预热的溶液C到沉淀中，充分吹打均匀。

20. 再加入150 uL （可称150-160 mg）预热的溶液D到离心管中，颠倒数次混匀。此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生。

21. 65℃放置3-5分钟。

22. 加入200 uL自备氯仿，震荡混匀10-30秒，此时溶液将呈乳白色。

23. 12000-15000 g室温离心2分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的1.5 mL塑料离心管中，避免触及中间的白膜。

24. 加入1.5倍体积的溶液E，颠倒混匀后全部转移到离心吸附柱中，室温放置至少2分钟。

25. 12,000 rpm室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液。

26. 通用洗柱液洗涤2次（将0.5 mL加入离心柱中，12,000 rpm室温离心1分钟，弃穿透液，此为洗涤，再重复）。

27. 空甩半分钟去除残留液体,将离心吸附柱转移到新的1.5 mL离心管中。

28. 加30-50 uL DNA 洗脱液，室温放置3-5分钟。

29. 12,000 rpm室温离心1分钟即得纯化的mtDNA溶液。