1．概述

黄曲霉毒素B1酶联免疫反应测试盒是用于检测谷类，饲料，肌肉，牛奶，花生和阿月浑子（开心果）油脂中黄曲霉毒素B1的残留。该试剂盒特点包括：

?         高回收率（80-105%），快速（10-20分钟）。

?         高灵敏度（0.05ng/g或ppb）

?         高重现性。

?         快速的ELISA检测方法（在不考虑样品数量下只需不到1.5小时）。

2．试剂盒原理黄曲霉毒素B1酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，抗原已经包被于微孔板上。分析时，样品同一抗加入孔中，如果样品中含有毒素，会竞争抗体，因而抑制板上包被的毒素与抗体结合。HRP标记的二抗，与结合在板上一抗相结合后，加入TMB底物，底物的颜色显色强度与样品中毒素的含量成反比。

3.试剂盒组成

本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存，有效期为一年。如果一个月内不使用试剂盒，黄霉素毒素B1标准品，一抗和HRP-二抗应置于-20℃或者冷冻保藏。

4.检测限

5.交叉反应

6．其他需要而本试剂盒未提的设备或材料

1)        酶标仪(450nm)

2)        恒温培养箱

3)        匀质器

4)        漩涡振荡器

5)        微量加样器(10、20、100和1000mL各一支)

1)        多道枪：50-300mL

2)        甲醇

7.注意事项

实验前请阅读以下文字，以保证获得实验效果。

1)        标准品中含有黄曲霉毒素B1，请小心使用。

2)        不要使用过期的试剂盒。

3)        不同批次的试剂盒不要混用，抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。确保二抗及二抗稀释液正确配制。

4)        尽量保持室温20-25℃，避免在通风口操作防止温度过低，过热和/或者蒸发。同样的，不要在阳光直射下实验，防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫若干纸巾或者其他物料。

5)        水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。

6)        加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。

7)        孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。

8)        从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。

9)        将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。

8．样品的准备

样品保存在2-4℃不超过1-2天，如果需要保存较长的时间，应该放置-20℃。样品使用前应恢复到室温。

1x饲料提取液的制备

将饲料提取浓缩物60g倒入200ml 容量瓶中，加入180ml蒸馏水，涡流2分钟混匀，室温下静置20分钟，容量瓶底部有少量结晶是正常现象，不影响使用。

1）  干肉/鱼，谷类，饲料，种子（花生）

快速提取方法

1)      研磨并混匀适量的样品；

2)      称取5g磨碎的样品，放入适当的容器中；

3)      加入25mL70%甲醇，用手或者振荡器剧烈振荡5分钟；

4)      室温（22.5±2.5）°C下4000 rpm离心10分钟；

5)      取100μL上清液加入1.9mL 35% 甲醇；

1)      取50μL作检测。

稀释倍数：100

备注：如果需要，样品所取的量可以增加，同时甲醇/水的用量也必须作相应的改变。例如取10g样品，应该加入50mL70%甲醇。

有机提取方法(针对高背景值样品或用快速提取回收率低的样品)

（1）             称取1g匀质样品，加入6ml 乙腈和2ml 1x饲料提取液；

（2）             转速涡流3分钟或震荡20分钟；

（3）             室温下4000g离心10分钟，取1ml上清到新试管中；

（4）             加入50mg 饲料清洗混合物，涡流30秒，室温静置5分钟；

（5）             室温下4000g离心10分钟，

（6）             转移120μL上清到新的试管中，50-60°C水浴中氮气吹干；

（7）             加入1ml 35%甲醇，涡流2分钟；

（8）             取50μL作检测。

稀释倍数：50

备注：如果样品含量低，第6步可以取600μL上清液，稀释倍数是10。

2）肌肉/肝脏/肾脏

（1）         研磨并混匀适量的样品；

（2）         称取5g磨碎的样品，放入适当的容器中；

（3）         加入25mL70%甲醇，用手或者振荡器剧烈振荡20分钟；

（4）         室温（22.5±2.5）°C下4000 rpm离心10分钟；

（5）         取1mL上清液，加入1mL蒸馏水或者去离子水稀释；

（6）         取50μL作检测。

稀释倍数：10

备注：如果需要，样品所取的量可以增加，同时甲醇/水的用量也必须作相应的改变。例如取10g样品，应该加入50mL70%甲醇。如果样品中黄曲霉毒素含量很高，那么样品必须经过稀释，请用35%甲醇进行稀释。

3）花生酱

（1）  研磨并混匀适量的样品

（2）  称取2g匀质的样品，放入适当的容器中

（3）  加入4mL35%甲醇，用手或者振荡器剧烈振荡20分钟

5±2.5）°C下4000 rpm离心10分钟

（5）  取50μL作检测

   稀释倍数：3

4）牛奶

（1）.脱脂牛奶：用35%甲醇按1：9的比例稀释牛奶样品（20ul牛奶+180ul35%甲醇），取50ul稀释样品以待检测

（2）.含脂牛奶：取适量样品，室温（22.5±2.5）°C4000g离心5min，弃去上层脂肪层，用35%甲醇按1：9的比例稀释牛奶样品（20ul牛奶+180ul35%甲醇），取50ul稀释样品以待检测

稀释倍数：10

5）蔬菜/豆类/花生/橄榄油

（1） 称取0.5g样品，加入2.5ml35%的甲醇；

（2） 涡流10分钟或高速涡流3分钟；

（3） 室温下4000g离心10分钟；

（4） 取600μL下层澄清液，加入1ml 正己烷，涡流1分钟，静置5分钟；

（5） 室温下4000g离心5分钟，去除上层正己烷；

（6） 取50μL下层液作检测。

    稀释倍数：5

9．酶联免疫反应测试步骤

试剂准备

注意：试剂在使用之前要在室温下解冻1-2小时，确定在使用前阅读过注意事项。准备适量的检测用试剂，所有的试剂摇匀后使用。准备足够所有小管所需的用量，不能将试剂倒回原来的瓶子中，处理试剂时建议用废弃的瓶子以降低污染的风险。

1x洗液的制备

1体积的20x洗液同19体积的蒸馏水混合

检测：

以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。

（1）         加入50mL的标准液于所设定的孔中；

（2）         加入50mL的样品于所设定的孔中

（3）         在每孔中加入100mL一抗， 轻敲微孔板边缘混匀60秒；

（4）         室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟

（5）         洗板3次，每次加入250mL 1×洗液，尽量甩干并在吸水纸上吸干；

（6）         每孔加入150mL 1×二抗工作液，室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟

（7）         洗板3次，每次加入250mL 1×洗液，尽量甩干并在吸水纸上吸干；

（8）         每孔加入100mL的TMB底物，用手敲板边缘1分钟混合均匀；

（9）         室温（22.5±2.5）°C避光孵育15分钟， 加入100mL的终止液终止反应。

（10）      在450nm下读OD值(读数前，用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕)。

10．结果计算

（1）         分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。

（2）         相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) ′ 100

（3）         以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度为横坐标建立标准曲线。

（4）         从标准曲线上读取质控和样品的浓度值。