凝胶过滤柱
凝胶过滤柱
凝胶过滤柱，也称为分子筛层析柱或尺寸排阻层析柱，是一种基于分子大小差异来分离混合物中各组分的色谱技术。
优缺点
1.优点：
条件温和，不损伤生物活性；
可在多种缓冲体系中使用；
重复性好，适合精细分离。
2.缺点：
分辨率相对较低（相比离子交换或亲和层析）；
上样量小；
洗脱体积大，目标物可能被稀释。
基本原理
凝胶过滤的核心原理是分子尺寸排阻效应：
凝胶介质由具有特定孔径的多孔微球（如交联葡聚糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺）组成。
当样品溶液流经凝胶柱时：
大分子无法进入凝胶颗粒内部孔隙，只能从颗粒间隙流过，路径短→先被洗脱出来；
小分子可进入凝胶孔内，路径长→后被洗脱出来；
中等大小分子则部分进入孔隙，洗脱时间介于两者之间。
主要应用
1.脱盐与缓冲液置换
使用如Sephadex G-25，快速去除小分子盐类、游离染料或未反应试剂。
2.蛋白质纯化
在多步纯化流程中作为最后一步，去除聚集体或降解片段。
3.分子量测定
通过标准蛋白校准曲线，估算未知蛋白的分子量。
4.分析蛋白聚集状态
检测单体、二聚体或多聚体比例（常用于抗体药物质量控制）。
操作要点
1.柱子平衡：用起始缓冲液充分平衡柱子，确保pH和离子强度稳定。
2.上样体积：通常不超过柱床体积的1–5%（分析用更少），避免过载影响分辨率。
3.流速控制：不宜过快，以保证分子有足够时间扩散进出凝胶孔。
4.避免气泡：气泡会扰乱流路，降低分离效果。
5.再生与保存：使用后用NaOH或乙醇清洗，按厂家建议保存（如20%乙醇，4°C）。