摘要：本研究旨在通过基因打靶技术，构建牛朊蛋白基因prnp的敲除载体，并转染牛胎儿成纤维细胞，实现prnp基因的高效敲除。利用正负筛选策略富集中靶细胞，最终获得了9个阳性细胞克隆。本研究为生产抗疯牛病的转基因牛提供了理论基础和技术支持。

引言：

朊蛋白（Prion protein）是动物传染性海绵状脑病的致病蛋白，由prnp基因编码的一种糖蛋白。在牛中，这种病症被称为疯牛病（BSE），是一种严重危害人类健康和世界经济发展的传染性疾病。疯牛病的病原体是PrPsc，一种内源性膜锚定蛋白PrPc（由prnp基因编码）的异构体。PrPsc诱导PrPc向PrPsc的转化是发病过程中的主要事件。因此，科学家推断PrPc缺失的动物因缺乏转化的底物而可能具有抵抗疯牛病的能力。

利用基因工程技术生产对疯牛病具有抵抗能力的“超级牛”成为当前研究的热点。基因打靶技术是实现这一目标的关键，它可以通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，定点修饰和改造基因DNA片段。在哺乳动物中，由于随机重组的频率远高于同源重组，因此构建高效的打靶载体并采用有效的筛选策略至关重要。

本研究利用正负筛选策略（Positive-negative selection, PNS），结合Cre-Loxp重组系统的原理，构建了牛朊蛋白基因prnp的敲除载体，并通过电穿孔法转染牛胎儿成纤维细胞，旨在获得prnp基因敲除的阳性细胞克隆，为生产抗疯牛病的转基因牛提供供体细胞。

材料与方法：

1. 材料与试剂：

   打靶载体PA2T、牛胎儿成纤维细胞由本实验室保存。EX Taq酶、pMD20-T Vector、DNA连接试剂盒购自某品牌公司，DNA凝胶回收试剂盒购自某品牌公司，各种限制性内切酶购自某品牌公司，无内毒素质粒大量提取试剂盒购自某品牌公司。细胞培养相关试剂包括基本培养基（DMEM）、胎牛血清、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、青霉素、链霉素等，均购自某品牌公司。G418购自某品牌公司，其他试剂购自某品牌公司等。

2. 基因组DNA的提取：

   无菌制备荷斯坦奶牛抗凝血，使用某品牌公司的血液/细胞/组织基因组提取试剂盒提取基因组DNA。

3. prnp基因打靶载体PBONP的构建：

   3.1 PCR扩增及克隆3'同源臂和5'同源臂：

   设计上下游引物，以牛全血基因组DNA为模板，进行PCR扩增。3'同源臂和5'同源臂的扩增产物分别连接到pMD20-T Vector载体上，转化感受态细胞DH5α，抽提质粒，经酶切及测序鉴定。

   3.2 3'、5'同源臂插入打靶载体PA2T：

   将测序正确的克隆的质粒与打靶载体PA2T同时用限制性内切酶双酶切，回收同源臂和骨架载体片段，通过T4 DNA连接酶连接，转化DH5α，提取质粒，酶切、PCR鉴定。

4. 细胞培养与转染：

   牛胎儿成纤维细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。使用威尼德电穿孔仪将打靶载体PBONP转染牛胎儿成纤维细胞。

5. 正负筛选：

   转染后的细胞分别用600μg/mL G418和200nmol/mL Ganciclovir（GCV）进行正负药物筛选，获得药物抗性细胞克隆。

6. 细胞克隆的鉴定：

   采用PCR、测序、间接免疫荧光试验及Western blotting试验对药物抗性细胞克隆进行鉴定，确定阳性细胞克隆。

实验结果：

1. prnp基因同源臂的扩增与克隆：

   通过PCR技术成功地从牛的全血基因组中扩增出prnp基因的两个同源臂，长度分别为1727bp和3860bp。测序结果表明，克隆出的同源短臂和同源长臂的序列与GeneBank上公布的基因序列一致。

2. 打靶载体PBONP的构建：

   以通用型打靶载体PA2T为基本骨架，将牛prnp基因的长短同源臂导入其中，成功构建了牛朊蛋白基因敲除载体PBONP。

3. 药物筛选：

   确立了G418和GCV的最小细胞致死浓度和维持浓度，G418的致死浓度和维持浓度分别为600μg/mL和300μg/mL，GCV的最小致死浓度和维持浓度分别为200nmol/mL和100nmol/mL。利用电穿孔法将打靶载体PBONP转染牛胎儿成纤维细胞，经过G418和GCV的正负筛选，最后得到176个药物抗性的细胞克隆。

4. 细胞克隆的鉴定：

   通过PCR、间接免疫荧光和Western blotting试验的多次鉴定，确定了176个药物抗性细胞克隆中有9个是阳性细胞克隆。这些阳性细胞克隆中的prnp基因被成功敲除。