引言

人绒毛膜促性腺激素β亚基（hCGβ）作为避孕疫苗的重要抗原，其单独使用时的免疫原性较弱，难以诱导强烈的免疫反应。尽管基于hCGβ的避孕疫苗已被证实安全、有效且避孕效果可逆，但其总有效率仅为80%-85%，不能在生殖道局部产生足够的抗原特异性抗体，这可能是避孕效果不完全的主要原因。乳酸杆菌作为人体的正常菌群，在粘膜局部持续表达抗原可诱发特异性免疫应答，因此被视为理想的疫苗载体。本研究旨在通过构建重组hCGβ乳酸杆菌，探索其经阴道粘膜免疫的可行性，以期为开发高效、安全的免疫避孕疫苗提供新的策略。

材料与方法

1. 材料

• 菌株与质粒：短小乳酸杆菌、干酪氏乳酸杆菌Lactobacillus casei CECT5276、pCMV4-hCGβ质粒、乳酸杆菌整合型表达载体pllac。

• 试剂：某品牌PCR试剂、某品牌DNA凝胶回收试剂盒、某品牌质粒提取试剂盒、某品牌放免试剂、某品牌Western blotting试剂、某品牌ELISA试剂。

• 仪器：某品牌PCR仪、某品牌电泳仪、某品牌离心机、威尼德电穿孔仪、某品牌酶标仪、某品牌Western blotting成像系统。

2. 方法

• 重组质粒构建：首先从短小乳酸杆菌基因组中PCR扩增得到670bp的S-层蛋白表达信号序列，将其信号肽序列与hCGβ基因连接后克隆入乳酸杆菌整合型表达载体pllac的lac启动子下游，得到质粒pllac-hCGβ。

• 电穿孔转化：将pllac-hCGβ电穿孔转化干酪氏乳酸杆菌Lactobacillus casei CECT5276，得到重组菌Lb casei hCGβ。通过PCR及测序分析外源基因在乳酸杆菌基因组中的整合情况。

• 诱导表达与鉴定：在无选择压力条件下培养重组菌50代后，接种培养，加入诱导剂乳糖，通过放免法检测培养上清及细胞裂解液中的hCGβ，Western blotting鉴定培养上清中的hCGβ蛋白。

• 动物实验：将稳定、分泌性表达hCGβ的乳酸杆菌菌株经阴道免疫8周龄BALB/c雌性小鼠，检测重组菌在小鼠阴道局部的抗原分泌水平及阴道局部特异性IgA抗体水平。

实验结果

1. 重组乳酸杆菌的构建与鉴定

   通过PCR及测序分析，证实hCGβ基因已经成功整合到Lb. casei的基因组中。重组菌产生的目的蛋白有78.5%分泌进入培养上清。在加入诱导剂乳糖后21小时，上清中的hCGβ浓度达到峰值，为440mIU/ml。Western blot分析显示22kDa的蛋白条带，证实重组乳酸杆菌确实可分泌hCGβ蛋白抗原。

2. 重组乳酸杆菌的阴道免疫效能

   将重组乳酸杆菌接种于小鼠阴道后，第3、7天阴道洗液中可检测到hCGβ，第14天阴道洗液中部分小鼠仍可检测到hCGβ，说明该重组菌可在阴道粘膜定居，并分泌hCGβ蛋白。通过ELISA法检测阴道洗液中的抗hCGβIgA抗体水平，结果显示，用不同剂量的重组菌经阴道粘膜免疫小鼠后，阴道洗液中均可检测到抗hCGβIgA抗体。

讨论

1. 重组hCGβ乳酸杆菌的构建意义

   本研究成功构建了稳定分泌hCGβ的乳酸杆菌，通过调节培养条件优化了hCGβ的分泌效率。这不仅为hCGβ在乳酸杆菌中的表达提供了理论依据，也为进一步开发免疫避孕疫苗奠定了实验基础。

2. 阴道粘膜免疫的机制与效果

   乳酸杆菌作为阴道的正常菌群，具有良好的安全性和免疫调节作用。通过阴道粘膜免疫，重组乳酸杆菌能够在生殖道局部产生高滴度的抗体，使抗生育作用更加直接、有效。本研究结果显示，重组乳酸杆菌能够有效诱导特异性IgA抗体的产生，验证了其作为免疫避孕疫苗载体的可行性。

3. 研究的创新与应用前景

   本研究创新地将hCGβ与乳酸杆菌结合，通过粘膜免疫途径诱导免疫反应，为免疫避孕疫苗的开发提供了新的策略。未来的研究可以进一步优化诱导条件，提高hCGβ的分泌量和稳定性，并探讨其在不同动物模型中的免疫效果。此外，该策略还可能应用于其他粘膜免疫相关疾病的预防和治疗，具有广阔的应用前景。

结论

本研究成功构建了稳定分泌hCGβ的乳酸杆菌，并通过阴道粘膜免疫小鼠验证了其免疫效能。实验结果显示，重组乳酸杆菌能够在阴道粘膜局部定居并分泌hCGβ蛋白，有效诱导特异性IgA抗体的产生。这一研究不仅为hCGβ在乳酸杆菌中的表达提供了理论依据，也为进一步开发高效、安全的免疫避孕疫苗奠定了坚实的基础。未来的研究将继续优化诱导条件，探讨其在不同动物模型中的免疫效果，并探索其在其他粘膜免疫相关疾病预防和治疗中的应用潜力。