摘要

本文采用高效化学转化重组法成功构建了重组腺病毒，详细描述了实验材料、方法以及结果。通过对构建体系的优化，提高了阳性重组率，为抗肿瘤生物治疗制剂的制备奠定了坚实基础。该法具有成本低、效率高、操作简便等优势，具有广阔的应用前景。

引言

重组腺病毒作为基因治疗的重要载体，因其宿主细胞范围广、转移效率高、滴度高及表达水平高等特点，广泛应用于肿瘤基因治疗、基因功能研究及疫苗开发等领域。然而，传统的重组腺病毒构建方法步骤繁琐、成本高且阳性重组率低，限制了其广泛应用。因此，优化重组腺病毒的构建方法，提高构建效率及阳性重组率，对于推进基因治疗研究具有重要意义。本研究采用高效化学转化重组法，旨在简化构建流程，提高构建效率，为制备具有更高抗肿瘤疗效的生物治疗制剂奠定基础。

材料与方法

1. 材料

• 质粒：穿梭质粒pAdTrack-CMV、腺病毒骨架质粒pAdEasy-1、携带目的基因的质粒（如p21基因质粒、pcDNA3.0-survivin）。

• 菌株：大肠杆菌DH5α、BJ5183（含腺病毒骨架质粒）。

• 细胞：人胚肾293细胞。

• 试剂：某试剂PmeⅠ、PacⅠ内切酶，某试剂酚:氯仿，某试剂乙醇，某试剂脂质体LipofectamineTM2000，某试剂DNA聚合酶，某试剂PCR纯化试剂盒，某试剂凝胶回收试剂盒，某试剂低熔点琼脂糖，某试剂总蛋白裂解酶，某试剂蛋白酶抑制剂，某试剂β-半乳糖苷酶检测试剂盒，某试剂T4 DNA连接酶。

• 仪器：某品牌PCR仪，某品牌电泳仪，某品牌离心机，某品牌超净工作台，某品牌倒置显微镜，某品牌超速离心机，某品牌超滤管，某品牌实时荧光定量PCR仪。

2. 方法

2.1 构建重组腺病毒转移质粒

1. PCR扩增目的基因：以携带目的基因的质粒为模板，通过PCR扩增获得目的基因全长序列。在5'端和3'端PCR引物中分别引入特定的酶切位点。

2. 酶切与连接：将PCR产物及穿梭质粒分别进行双酶切，回收目的基因片段及穿梭质粒载体片段，用T4 DNA连接酶进行连接，构建重组穿梭质粒。

3. 转化与鉴定：将连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过PCR及酶切鉴定筛选出阳性克隆，并进行测序验证。

2.2 同源重组构建重组腺病毒质粒

1. 线性化穿梭质粒：用PmeⅠ酶切重组穿梭质粒，回收线性化穿梭质粒。

2. 化学转化法同源重组：将线性化穿梭质粒与腺病毒骨架质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，筛选出阳性克隆。

3. 鉴定与纯化：通过PacⅠ酶切鉴定同源重组成功的质粒，并用大抽质粒试剂盒进行大量质粒抽提。

2.3 包装与扩增重组腺病毒

1. 线性化重组腺病毒质粒：用PacⅠ酶切重组腺病毒质粒，回收线性化质粒。

2. 脂质体介导转染293细胞：将线性化质粒用脂质体LipofectamineTM2000介导转染至293细胞，进行包装。

3. 观察与收集病毒：观察细胞病变效应（CPE），收集病变细胞，通过反复冻融、离心等方法制备病毒上清。

2.4 病毒纯化与滴度测定

1. 病毒纯化：采用碘克沙醇密度梯度离心或层析法纯化病毒。

2. 滴度测定：通过实时荧光定量PCR法测定病毒滴度。

实验结果

1. 重组腺病毒转移质粒的构建

成功构建了携带目的基因的重组腺病毒转移质粒，通过PCR及酶切鉴定，证实目的基因已成功插入穿梭质粒中。

2. 同源重组构建重组腺病毒质粒

采用化学转化法，成功实现了穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的同源重组，通过PacⅠ酶切鉴定，筛选出阳性克隆，获得了重组腺病毒质粒。

3. 包装与扩增重组腺病毒

将重组腺病毒质粒转染293细胞，观察到明显的CPE，收集病变细胞制备病毒上清。通过反复冻融、离心等方法，成功获得了重组腺病毒颗粒。

4. 病毒纯化与滴度测定

采用碘克沙醇密度梯度离心或层析法纯化病毒，获得了高纯度的重组腺病毒。通过实时荧光定量PCR法测定病毒滴度，结果显示病毒滴度达到较高水平。

讨论

1. 高效化学转化重组法的优势

本研究采用高效化学转化重组法构建重组腺病毒，相比传统方法，具有以下优势：

• 简化流程：减少了繁琐的步骤，提高了构建效率。

• 降低成本：减少了试剂及材料的消耗，降低了实验成本。

• 提高阳性重组率：通过优化同源重组条件，提高了阳性重组率，确保了实验的可靠性。

2. 实验策略的创新性

• 引入化学转化法：将化学转化法应用于同源重组，提高了重组效率。

• 优化纯化方法：采用碘克沙醇密度梯度离心或层析法纯化病毒，提高了病毒的纯度及滴度。

• 多基因检测：通过构建携带不同目的基因的重组腺病毒，验证了该方法的通用性及适用性。

3. 应用前景

重组腺病毒作为基因治疗的重要载体，具有广阔的应用前景。本研究构建的高效化学转化重组法，为制备具有更高抗肿瘤疗效的生物治疗制剂奠定了坚实基础。该方法可广泛应用于肿瘤基因治疗、基因功能研究及疫苗开发等领域，具有重要的理论意义及实用价值。

结论

本研究采用高效化学转化重组法成功构建了重组腺病毒，通过优化构建流程，提高了阳性重组率及构建效率。该方法具有成本低、效率高、操作简便等优势，为抗肿瘤生物治疗制剂的制备提供了有力支持。未来，将进一步探索该方法的优化及应用，为基因治疗研究做出更大贡献。