引言瘢痕疙瘩是一种皮肤纤维组织过度增生性疾病，其发病机制复杂，严重影响患者的外观和生活质量。原代瘢痕疙瘩成纤维细胞在瘢痕疙瘩的研究中具有重要意义，通过对其进行基因操作，能深入了解瘢痕疙瘩的发病机制以及寻找潜在治疗靶点。电穿孔法作为一种高效的基因导入技术，在多种细胞类型中得到应用。然而，针对原代瘢痕疙瘩成纤维细胞的电穿孔转染条件，仍需进一步探索和优化。

一、原代瘢痕疙瘩成纤维细胞概述

（1）细胞特性

原代瘢痕疙瘩成纤维细胞具有独特的生物学特性。与正常皮肤成纤维细胞相比，它增殖能力更强，能合成和分泌大量的细胞外基质成分，如胶原蛋白、纤连蛋白等，导致瘢痕组织过度增生。这些细胞的异常生物学行为是瘢痕疙瘩形成和发展的关键因素。

（2）研究意义

对原代瘢痕疙瘩成纤维细胞进行研究，有助于揭示瘢痕疙瘩的发病机制。通过基因层面的操作，改变细胞内某些基因的表达，观察其对细胞增殖、凋亡以及细胞外基质合成的影响，从而为开发新的治疗方法提供理论依据。例如，抑制某些促进细胞增殖和细胞外基质合成的基因表达，有望成为治疗瘢痕疙瘩的新策略。

二、电穿孔法转染原理

（1）基本原理

电穿孔法是利用瞬间高压电场在细胞膜上形成可逆的微孔。当细胞膜处于高电场强度环境中，膜两侧产生电势差，当电势差达到一定程度时，细胞膜的脂质双分子层结构发生改变，形成微小的孔洞。这些孔洞允许外源性物质，如 DNA、RNA、蛋白质等进入细胞内部。

（2）优势与局限性

电穿孔法的优势在于其转染效率相对较高，适用于多种细胞类型，包括一些难以转染的细胞。然而，它也存在局限性，如较高的细胞毒性。在高电场强度和长时间脉冲条件下，细胞可能会受到较大损伤，导致细胞活力下降、凋亡增加等。因此，对于原代瘢痕疙瘩成纤维细胞这种对培养条件较为敏感的细胞，优化电穿孔转染条件至关重要。

三、实验材料与方法

（1）实验材料

• 细胞来源：手术切除的瘢痕疙瘩组织，取自患者（经患者知情同意）。

• 主要试剂：DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素 - 链霉素双抗、电穿孔缓冲液、无内毒素的质粒 DNA（含有目的基因，如绿色荧光蛋白 GFP 基因，用于观察转染效果）、台盼蓝染液。

• 实验仪器：超净工作台、CO?培养箱、离心机、倒置显微镜、电穿孔仪、细胞培养板、移液器等。

（2）原代瘢痕疙瘩成纤维细胞的培养

• 组织处理：将手术切除的瘢痕疙瘩组织置于含双抗的 PBS 中，冲洗去除血液和杂质。将组织剪成约 1mm3 大小的组织块，用 0.25% 胰蛋白酶在 37℃消化 30 - 45 分钟。

• 细胞接种：消化结束后，加入含血清的培养基终止消化，轻轻吹打组织块，使细胞分散。将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm 离心 5 分钟，弃上清。用新鲜培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，置于 37℃、5% CO?培养箱中培养。

• 细胞传代：待细胞融合至 80% - 90% 时，进行传代培养。用胰蛋白酶消化细胞，按 1:2 或 1:3 的比例接种到新的培养瓶中。取第 3 - 5 代细胞用于电穿孔转染实验。

（3）电穿孔法转染实验步骤

• 细胞准备：收集对数生长期的原代瘢痕疙瘩成纤维细胞，用胰蛋白酶消化后，离心收集细胞沉淀。用预冷的电穿孔缓冲液重悬细胞，调整细胞密度至 1×10? - 5×10?个 /ml。

• DNA 准备：将无内毒素的质粒 DNA 用无菌水稀释至合适浓度，如 1 - 5μg/μl。

• 电穿孔操作：取 100μl 细胞悬液与适量的质粒 DNA 混合，轻轻混匀后转移至电穿孔杯中。将电穿孔杯放入电穿孔仪中，设置不同的电场强度（如 100V/cm、200V/cm、300V/cm）、脉冲时间（如 10ms、20ms、30ms）和脉冲次数（如 1 次、2 次、3 次）进行电穿孔处理。电穿孔结束后，迅速将细胞悬液转移至含预热培养基的培养板中，轻轻摇匀。

• 细胞培养与观察：将培养板置于 37℃、5% CO?培养箱中培养。在转染后 24 小时、48 小时和 72 小时，用倒置显微镜观察细胞形态和绿色荧光蛋白的表达情况，评估转染效率。同时，用台盼蓝染液染色，计算细胞活力。

四、实验结果与分析

（1）转染效率分析

• 在不同电场强度下，转染效率呈现明显差异。当电场强度为 100V/cm 时，转染效率较低，GFP 阳性细胞数量较少；随着电场强度增加到 200V/cm，转染效率显著提高，GFP 阳性细胞数量明显增多；但当电场强度进一步升高到 300V/cm 时，转染效率并未持续上升，反而出现部分细胞死亡，GFP 阳性细胞数量减少。

• 脉冲时间对转染效率也有影响。在较短的脉冲时间（如 10ms）下，转染效率较低；当脉冲时间延长至 20ms 时，转染效率有所提高；然而，当脉冲时间达到 30ms 时，细胞毒性明显增加，转染效率也未明显改善。

• 脉冲次数方面，1 次脉冲时转染效率相对较低，2 次脉冲时转染效率有所提高，但 3 次脉冲时细胞死亡率显著增加，转染效率并未显著提升。综合来看，在电场强度为 200V/cm、脉冲时间为 20ms、脉冲次数为 2 次的条件下，原代瘢痕疙瘩成纤维细胞的转染效率较高，可达 30% - 40%。

（2）细胞毒性分析

• 通过台盼蓝染色检测细胞活力发现，随着电场强度的增加、脉冲时间的延长和脉冲次数的增多，细胞死亡率逐渐升高。在高电场强度（300V/cm）、长脉冲时间（30ms）和多次脉冲（3 次）条件下，细胞死亡率可超过 50%。而在优化后的条件（200V/cm、20ms、2 次）下，细胞活力仍能保持在 70% - 80%，表明该条件下细胞毒性相对较低。

（3）影响因素综合讨论

• 电场强度是影响转染效率和细胞毒性的关键因素。适当提高电场强度可增加细胞膜的通透性，促进 DNA 进入细胞，但过高的电场强度会对细胞膜造成不可逆损伤，导致细胞死亡。

• 脉冲时间和脉冲次数也与转染效率和细胞毒性密切相关。较短的脉冲时间可能不足以使 DNA 有效进入细胞，而过长的脉冲时间和过多的脉冲次数会增加细胞损伤的风险。

• 此外，细胞密度、DNA 浓度等因素也会对电穿孔转染效果产生影响。在实验中发现，细胞密度过低或过高都不利于转染，合适的细胞密度（1×10? - 5×10?个 /ml）能获得较好的转染效果。DNA 浓度过高可能会导致细胞内 DNA 聚集，影响转染效率，而过低的 DNA 浓度则会使进入细胞的 DNA 量不足，同样影响转染效果。

五、结论与展望

（1）研究结论

本研究通过对电穿孔法转染原代瘢痕疙瘩成纤维细胞的条件进行优化，发现电场强度为 200V/cm、脉冲时间为 20ms、脉冲次数为 2 次，细胞密度为 1×10? - 5×10?个 /ml ，DNA 浓度在 1 - 5μg/μl 时，能在保证一定细胞活力的前提下，获得较高的转染效率。这些优化条件为进一步研究原代瘢痕疙瘩成纤维细胞的基因功能和发病机制提供了有力的技术支持。

（2）研究展望

未来，针对原代瘢痕疙瘩成纤维细胞的电穿孔转染技术还可从以下方面进一步发展。一方面，开发更加精准的电场调控技术，实现对细胞的特异性转染，减少对周围正常细胞的影响。另一方面，探索新的电穿孔缓冲液或添加剂，降低细胞毒性，提高转染效率。此外，结合其他基因递送技术，如病毒载体转染等，优势互补，可能会为瘢痕疙瘩的研究和治疗带来新的突破。总之，电穿孔法在原代瘢痕疙瘩成纤维细胞的基因操作中具有重要应用潜力，通过不断优化转染条件，有望为瘢痕疙瘩的基础研究和临床治疗提供更多有价值的信息。