摘要：本研究聚焦噬菌体纳米抗体展示库电转化效率提升难题。通过系统调控电转化关键参数，如电压、电容、脉冲时长及感受态细胞状态等，经多轮对比实验，成功优化条件，显著提高转化效率，为高质量纳米抗体库构建及筛选奠定坚实基础，拓展其在生物医学领域应用潜能。

一、引言

噬菌体展示技术作为新兴的强大生物技术平台，在抗体工程领域占据关键地位，尤其是纳米抗体的筛选与开发，依赖高效的噬菌体展示库构建。电转化作为将外源 DNA 高效导入感受态细胞的关键步骤，其效率直接关乎噬菌体展示库的质量与多样性。然而，当前常规电转化条件在噬菌体纳米抗体展示库构建时存在转化效率不稳定、细胞损伤大等诸多局限，严重制约后续功能抗体筛选及相关应用拓展，亟待精准优化以突破瓶颈。

二、材料与方法

2.1 实验材料

1. 菌株：选用大肠杆菌 TG1 菌株，其具备高效摄取外源 DNA 能力且利于噬菌体增殖，确保实验基础可靠性，购自专业菌种保藏中心，复苏后经严格平板划线纯化，-80°C 甘油保存备用。

2. 载体：采用特定噬菌体载体，经基因工程改造，含有纳米抗体基因片段插入位点及筛选标记，由实验室前期构建并测序验证准确性，提取纯化后 -20°C 储存，浓度与纯度满足实验要求。

3. 试剂：优质电转感受态细胞制备试剂盒，确保制备细胞高效感受态；各类限制性内切酶、连接酶等分子生物学工具酶，均为高活性知名品牌产品；电转化缓冲液自行精确配制，含适量蔗糖、镁离子等关键成分，调节渗透压与离子强度。

2.2 实验设计

1. 电压梯度设置：以常规电转化仪为平台，设置 1.0 kV、1.25 kV、1.5 kV、1.75 kV、2.0 kV 五组不同电压，每组至少 3 个平行样本，固定电容 25 μF、脉冲时长 5 ms，探究电压对转化效率及细胞存活率影响，记录转化后菌落数及细胞生长曲线。

2. 电容调节：选定最佳电压后，将电容设为 15 μF、20 μF、25 μF、30 μF、35 μF，维持电压与脉冲时长不变，重复转化操作，分析电容变化下电穿孔效果差异，通过流式细胞术检测细胞穿孔率辅助评估。

3. 脉冲时长优化：在优化电压、电容基础上，对脉冲时长从 3 ms 至 7 ms 以 1 ms 间隔细分测试，深入剖析短暂强脉冲与稍长弱脉冲对 DNA 摄入及细胞完整性不同作用机制，结合显微镜观察细胞形态完整性。

2.3 感受态细胞预处理优化

1. 培养温度精细调控：对比 30°C、32°C、34°C、36°C、37°C 培养大肠杆菌至对数生长期收获制备感受态，考察不同温度下细胞膜流动性、蛋白表达差异对转化接纳能力影响，测定细胞膜脂肪酸饱和度等指标。

2. 预处理添加剂筛选：向感受态制备体系分别添加 0.5% DMSO、1% 甘油、0.2 M 甜菜碱等化学试剂，探究其对细胞膜通透性、细胞抗电击能力提升作用，利用荧光探针监测细胞膜电位变化验证添加剂效果。

2.4 转化后复苏培养优化

1. 复苏培养基改良：设计含不同浓度葡萄糖、氨基酸组合复苏培养基，旨在快速补充细胞能量、修复损伤，对比标准 LB 培养基，监测转化细胞起始生长速率及延滞期时长。

2. 复苏时间精准确定：设定 30 min、60 min、90 min、120 min、150 min 不同复苏时长，考察细胞从电冲击损伤恢复及外源 DNA 稳定表达所需最短且高效时段，通过实时定量 PCR 检测噬菌体基因转录起始时间。

三、结果与讨论

3.1 电压对电转化的影响

随电压升高，转化效率呈先升后降趋势，1.5 kV 时菌落数达峰值，较 1.0 kV 提升约 3 倍；但高于 1.75 kV 后，细胞存活率急剧下降，显微镜下可见大量破碎细胞，表明过高电压虽增强 DNA 驱动力却严重破坏细胞膜，权衡效率与细胞存活，1.5 kV 为初步优选电压，后续实验以此为基拓展优化。

3.2 电容调整效果

电容从 15 μF 增至 25 μF，转化效率稳步上升，25 μF 时达平台期，继续增大电容无显著提升，反因电场能量过度积累微增细胞损伤，结合穿孔率数据，确认 25 μF 为适配电容，与选定电压协同构建适宜电穿孔电场强度与时长组合，保障 DNA 足量进入细胞且维持细胞活性。

3.3 脉冲时长优化结果

4 ms 脉冲时长转化效率最优，短于此时长 DNA 进入不充分，长于则加剧细胞应激损伤，细胞膜完整性受损严重，特定基因表达失调，该时长平衡电脉冲刺激与细胞耐受，使外源 DNA 精准、高效整合入细胞基因组，为后续噬菌体复制与展示奠定基础。

3.4 感受态细胞预处理效能

34°C 培养制备感受态细胞转化表现卓越，细胞膜流动性适中，关键转运蛋白丰度高，利于 DNA 结合与内化；1% 甘油添加组细胞膜稳定性增强，电击后维持较好完整性，减少内容物泄漏，两者协同预处理使转化效率较原始条件提升近 5 倍，极大扩充可转化细胞基数。

3.5 转化后复苏策略优化成效

含 0.2% 葡萄糖与适量脯氨酸、缬氨酸的复苏培养基显著缩短细胞延滞期，加速修复损伤恢复生长；90 min 复苏时长足以完成细胞膜修复、DNA 转录起始及噬菌体组装关键进程，过早终止复苏致转化不稳定，过长则营养耗尽抑制生长，优化后整体转化效率提升约 60%，保障高活性噬菌体展示库产出。

四、结论

本研究经全方位、精细化电转化条件探索，确定 1.5 kV 电压、25 μF 电容、4 ms 脉冲时长组合，配合 34°C 培养及甘油预处理感受态细胞，采用特制复苏培养基与 90 min 时长，构建全新高效电转化流程。该优化体系大幅提升噬菌体纳米抗体展示库转化效率，降低细胞损伤，增强库多样性与功能性，为纳米抗体研发提供更优质资源库，助力精准靶向治疗、生物传感等前沿应用突破技术屏障，开拓广阔前景，后续将聚焦大规模验证及跨体系适配性研究。