杂交瘤技术，作为现代生物技术的瑰宝，自诞生以来便在生物医学领域产生了深远的影响。其基本原理在于利用细胞融合技术，将免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，从而得到一种新型的杂交细胞——杂交瘤细胞。这种细胞既保留了B淋巴细胞产生特异性抗体的能力，又继承了骨髓瘤细胞无限增殖的特性。通过筛选和克隆，我们可以获得稳定产生特定抗体的杂交瘤细胞系，进而制备出高纯度、高特异性的单克隆抗体。下面是具体的关于杂交瘤技术原理及应用：

杂交瘤技术的基于三种关键技术。

一、动物免疫

将特定的抗原注射到哺乳动物（如小鼠）体内，在外来抗原刺激下，被免疫动物脾脏内的B淋巴细胞大量增殖并且分泌针对于该抗原的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外来抗原对动物进行免疫，以刺激能分泌特异性抗体的B淋巴细胞大量增殖。

二、细胞融合

B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间（两周）便死亡-短命细胞；而骨髓瘤细胞不分泌抗体，却能在体外无限增殖存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞，细胞融合杂交瘤细胞中非常关键的一个步骤。

通常使用的细胞融合技术有生物方法如仙台病毒，化学方法如聚乙二醇（PEG），物理方法如电融合。

B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合脾细胞，未融合骨髓瘤细胞，脾细胞-脾细胞融合体，骨髓瘤细胞-骨髓瘤细胞融合体，脾细胞-骨髓瘤细胞杂合体（杂交瘤细胞）。其中，我们需要利用另一个关键技术-杂交瘤细胞筛选-将所需的杂交瘤细胞分离出来。

三、杂交瘤细胞筛选

筛选杂交瘤细胞一般使用HAT培养基。

HAT培养基筛选方法基本原理：

HAT培养基成分：含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。

细胞DNA合成途径：主要合成和补救合成途径两种方式。主要合成就是利用糖和氨基酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而补救合成途径则是通过次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase， HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase，TK)将核苷酸前体合成核苷酸以供DNA合成原料。

HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断DNA合成的内源性途径。融合前的骨髓瘤细胞不能产生抗体，并且缺乏次黄嘌呤  – 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）基因，使得它们对HAT培养基敏感，阻断了DNA补救合成途径。

将融合的细胞在HAT培养基中孵育大约10至14天，未融合的以及自身融合的骨髓瘤细胞死亡。这是因为HAT培养基阻断了骨髓瘤细胞两大DNA合成途径。未融合的以及自身融合的B淋巴细胞虽然能够合成HGPRT酶，但其是正常细胞，存活一段时间（两周）也死亡。因此，在HAT养基中，只有B细胞-骨髓瘤杂合体存活，因为杂交瘤细胞继承了B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成HGPRT酶和TK酶。这些杂交瘤细胞能够分泌抗体（B细胞特性）并且无限增殖（骨髓瘤细胞特性）。

然后将培养基稀释到多孔板中，使得每个孔仅含有一个杂交瘤细胞。再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株。由于孔中的抗体由相同的B细胞产生，针对相同的抗原表位，所以产生的抗体又被称之为单克隆抗体。

接下来采用体内或者体外方式对筛选的能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养，最后收集提纯获取单抗。

杂交瘤技术应用：

①疾病诊断：单克隆抗体在疾病诊断中发挥着重要作用，以其准确且无交叉反应的特点，显著提高了诊断的准确性。例如，在乙型肝炎及潜伏的乙型肝炎病毒的诊断中，单克隆抗体能显著减少假阴性的漏诊。

②治疗载体：单克隆抗体也可以作为治疗疾病的载体。通过与抗肿瘤药物结合，单克隆抗体能在体内选择性集中攻击肿瘤细胞，具有靶向性，从而减少对正常组织的损伤并减轻抗癌药物的副作用。这种载药单克隆抗体被誉为“生物导弹”。

③抗体序列保护：获取抗体基因序列后，可以通过专利对CDR区进行保护，从而保护创新性的抗体序列。

④生产方式备份：由于杂交瘤存在退化转阴的风险，抗体序列可以通过基因工程方式轻松获得抗体样品，为生产方式提供备份。

⑤抗体工程改造：获得的抗体序列可用于抗体人源化、双特异性抗体等抗体工程改造项目，进一步拓展抗体的应用范围和效果。

⑥癌症研究：杂交瘤技术可以制备大量的特异性抗体，用于检测肿瘤标志物、研究癌细胞的生物学特性、筛选分子靶点等。此外，该技术还可以用于检测肿瘤细胞表面的抗原，通过对来自不同患者的癌瘤细胞进行克隆化和筛选，发现不同肿瘤的抗原异质性，为临床肿瘤治疗提供新的思路和策略。

总的来说，杂交瘤技术以其独特的优势在多个领域都有着广泛的应用，为生物医学研究和疾病治疗提供了有力的工具。

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