免疫组织化学（IHC）是一种实验技术，通过使用一抗来检测组织切片中细胞内的蛋白质（抗原）。在间接检测法中，一抗常与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗结合。最后，利用如DAB等底物来显现染色，以可视化抗原的存在。

HRP辣根过氧化物酶标记的二抗通常用于如免疫印迹、酶联免疫吸附试验以及免疫组织化学等应用。然而，对于免疫荧光而言，二抗需要带有在激发光下激发的荧光基团，常用的标记物为异硫氰酸荧光素(FITC)和罗明达B200(RB200)标记的抗体。

因此，HRP标记的二抗不能直接用于免疫荧光。

使用 HRP 二抗时，优化 IHC 实验的简便技巧:

①选择合适的 HRP 二抗

务必确保 HRP 二抗与一抗的相容性。举个例子，如果一抗在兔体内制备，则应使用抗兔 HRP 二抗。如需了解更多技巧，请查看我们的二抗选择指南。

②在 IHC 染色过程中，如何选择 HRP 二抗的初始稀释度？

HRP 二抗的最佳稀释度取决于一抗。我们建议在 1/1,000 至 1/100,000 这一范围内进行试滴定。

③对于 HRP 标记的二抗，建议使用哪种缓冲液？

可使用含 TBS 的 1% BSA。Abcam 建议使用 TBS，因为 TBS 的背景比 PBS 更干净。如果仍然遇到高背景染色，您可以增加 BSA 浓度或使用含 5% 牛奶的 TBS。

请注意，二抗可能与组织中的内源性免疫球蛋白发生交叉反应。用二抗种属的普通血清预处理组织，可最大限度地减少交叉反应。一抗孵育前，使用普通血清进行封闭还可避免 Fc 受体与一抗和二抗的结合。加入 BSA 能够减少疏水作用引起的非特异性结合。

④是否需要预吸附二抗？

预吸附二抗可减少非特异性背景，因为它们不太可能表现出种属交叉反应性，或与预吸附种属的内源性抗原反应。二抗应针对样本来源种属进行预吸附。例如，对人体组织或细胞进行染色时，建议使用预先吸附了抗人血清的 HRP 二抗。

⑤什么是证明二抗特异性染色的良好对照？

为了证明二抗与一抗发生特异性反应，我们建议进行对照试验，即添加不含一抗的 HRP 二抗。如果在对照样本中观察到染色，则结果表明 HRP 二抗与组织上的内源性免疫球蛋白发生非特异性反应。

⑥孵育时间

室温孵育 1 小时即可。如果信号较弱，可于 4°C 孵育过夜。

更多详情可以查看优质二抗列表页：https://cn.sinobiological.com/category/secondary-antibodies-list

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