免疫组化法（IHC）是使用抗体检测组织切片（例如肝脏、胰腺或心脏）中细胞蛋白质（抗原）的过程。

当组织样本被送到实验室进行疾病检查时，有几个细节不易确定。几种疾病或疾病亚型在显微镜下可能看起来相似或看起来具有相似大小的细胞，但具有不同的行为和必要的治疗，区分它们的最佳方法是检测这些细胞上作为标记的特定分子。免疫组化法（IHC）是一种使用抗体（匹配分子）的技术，用于寻找、识别附着在细胞上的标记物。在显微镜下可以看到抗体本身，这有助于技术人员进行精确识别。

免疫组化法（IHC）已广泛应用于医学中，特别是癌症诊断。淋巴瘤是依赖于IHC进行正确诊断和治疗决策的癌症之一。

免疫组化常见问题：

问题一：我应该使用PIER还是HIER进行抗原修复？

固定过程可能会掩盖抗原，导致抗体结合无法进行。这种掩盖可以通过一种称为抗原修复/抗原去掩蔽的技术来逆转，该技术可以通过加热（HIER；热诱导抗原修复）或蛋白酶（PIER；蛋白水解诱导抗原修复）介导。后者使用蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等酶。PIER方法通过降解掩盖表位的肽而起作用。然而，PIER也可能导致样品形态或抗原本身的改变。因此，PIER的使用频率低于HIER，后者通过恢复表位的二级和三级结构而起作用。

为了确定是否应该进行抗原修复以及采用哪种方法，应遵循以下指南：

进行文献检索，以确定其他研究人员如何可视化您感兴趣的抗原。

检查抗体供应商是否推荐了特定的抗原修复方案。

如果没有特定的协议可用，我们建议使用HIER而不是PIER协议。

对于HIER，总是使用中性抗原修复缓冲液，如AbD Serotec的BUF025A，并与未进行抗原修复的样品进行比较。

如果中性染色溶液没有产生良好的染色效果，则应测试碱性或酸性抗原修复缓冲液。除了pH值外，其他需要优化的参数是温度和持续时间。理想情况下，尝试各种pH值、温度和时间组合。

为了排除由HIER过程引起的伪影，始终包括一个控制样品，该样品在没有HIER步骤的情况下进行染色。

问题二：如何选择IHC实验的抗体，单克隆抗体还是多克隆抗体？

单克隆抗体和多克隆抗体的抗体特性决定了其优缺点。单克隆抗体是针对单个表位的同种免疫球蛋白。抗体是由一个动物的单个B细胞克隆产生的，因此在免疫化学上相似。多克隆抗体是针对同一抗原的各种表位的异质抗体混合物。抗体是由动物的不同B细胞克隆产生的，因此在免疫化学上不同。多克隆混合物中的抗体可能具有略微不同的特异性和亲和力。

如果蛋白质靶标具有相同的氨基酸序列，单克隆抗体更合适。一旦抗原因各种原因发生构象变化，如蛋白质相互作用、翻译后修饰、温度、pH值、固定、盐浓度等，单克隆抗体和抗原的联合作用将受到严重影响。由于多克隆抗体具有多个表位，不受蛋白质构象变化的影响，一般来说，在一定范围内的pH和盐浓度内，多克隆抗体之间的抗原结合比单克隆抗体更稳定。

问题三：一抗的孵育时间多久？

一抗的孵育时间与温度,抗体浓度有关。一般情况下,在37℃的条件下,孵育1-2小时左右。在室温的条件下,孵育3小时左右。在4℃的条件下,孵育18-24小时左右。

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