ELISA酶联免疫吸附实验是将已知的抗原或抗体结合在固相载体表面，然后利用酶标记（偶联）的抗体或抗原与之孵育，在通过显色物显色，其显色深浅与待测物质的含量成正比，用肉眼即可观察。在ELISA实验中，有三种必需的试剂：已知的抗原或抗体（用于结合到固相载体上）；酶标的抗体或抗原（标记物）；显色剂（用于显色）。

常见的ELISA实验有四种：直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA和竞争ELISA。

①直接ELISA (Direct ELISA)

直接ELISA法是将抗原固定于ELISA板上，然后用酶标抗体直检测抗原。

相较于其它类型的ELISA实验，直接ELISA实验步骤少，检测速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反应，测定结果不容易出错。但是由于直接ELISA的抗原不是特异性固定的，样本中的所有蛋白质（靶蛋白及其他杂质蛋白）都会与ELISA板结合，实验背景会比较高。而且直接ELISA每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验不太灵活。另外由于没有使用二抗，信号没有被放大，降低了测定的灵敏度。

对抗原的免疫反应进行分析，通常会使用直接ELISA。

优点 ：

步骤少，实验周期更短

较低的交叉反应，实验不容易出错

最佳用途：分析抗原的免疫反应

缺点：

背景高

灵活性差，需要针对每种靶蛋白的特异性一抗

检测灵敏度不够高：没有使用二抗，信号没有放大

②间接ELISA (Indirect ELISA)

间接ELISA法是先将抗原结合到ELISA板上，随后分两步进行检测：首先加入检测抗体与抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。

与直接ELISA相比，间接ELISA用到酶标二抗，具有更高的灵敏度，也需要更少的标记抗体，更经济。间接ELISA还提供了更大的灵活性，因为不同的一抗能够与单一标记的二抗一同使用。间接ELISA实验的缺点是存在交叉反应的可能性（酶标二抗直接与抗原结合），可能会增加背景，同时与直接ELISA相比，间接ELISA实验多了二抗孵育的步骤，实验周期增长。

间接ELISA法适合测定样品中总抗体的浓度。

优点 ：

高灵敏度

更经济

更灵活

最佳用途：测定样品中总抗体的浓度

缺点：

可能存在交叉反应

比直接ELISA法实验周期长

③夹心ELISA (Sandwich ELISA)

夹心ELISA实验需要用到配对抗体（捕获抗体和检测抗体），其实验原理是将捕获抗体结合到ELISA板上，通过捕获抗体固定抗原，随后通过直接ELISA或间接ELISA的方式进行检测，实验流程如下图所示。在夹心ELISA实验中，最重要的是对配对抗体进行验证，确保配对抗体能同时与抗原结合，以确保实验的顺利进行。

夹心ELISA实验先将捕获抗体固定于ELISA板孔中，然后加入分析物或样品，接着加入检测抗体。如果检测抗体是酶标抗体，则可称为直接夹心ELISA；如果检测抗体不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称为间接夹心ELISA。夹心ELISA的灵敏度高，它比直接或间接ELISA敏感2-5倍；同时夹心ELISA使用两种特异性抗体与抗原结合，拥有很高的特异性。另外夹心ELISA能够通过直接或间接的方式进行检测，有着不错的灵活性。夹心ELISA的缺点是对配对抗体要求很高，如果没有标准化的试剂盒或者已经通过测试的配对抗体，则需要进行配对抗体定制并进行优化，因为降低捕获抗体与检测抗体之间的交叉反应是非常重要的。

夹心ELISA尤其适用于复杂样品的分析，因为抗原不经纯化仍具能有高灵敏度和特异性（例如测量免疫应答中的细胞因子水平）。

优点 ：

灵敏度高

特异性好

更灵活

最佳用途：对复杂样品进行分析

缺点：

对于配对抗体的要求高（了解更多配对抗体）

④竞争ELISA (Competition ELISA)

竞争ELISA也成为阻断ELISA，是所有ELISA实验中最复杂的，但是以上介绍的三种ELISA类型都适用于竞争ELISA的形式。竞争ELISA主要用于通过检测对预期信号输出去测量样品中抗原或抗体的浓度：

在竞争ELISA实验中，样品中的抗原或抗体竞争性的结合特定数量的酶标抗体或抗原。样品中抗原浓度越高，输出信号越弱，信号输出与样品中抗原的量成反比。

优点 ：

无需样品处理，可检测原油或不纯的样品

重复性好：重复样品和分析之间的差异更小

灵活性高：可基于直接、间接或夹心ELISA

更稳健：对样品稀释和样品基质效应的敏感性低于夹心ELISA

最佳用途：常用于只有一种抗体可用于目标抗原的情况，也适用于检测不能被两种不同抗体结合的小抗原

缺点：操作繁琐

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