光定量 PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR，qPCR）也称作实时荧光定量 PCR。它是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时检测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对初始模板进行定量分析的方法。该技术于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出，它的出现解决了传统 PCR 不能对初始模板定量分析的问题。荧光定量 PCR 具有准确性高、灵敏度高、特异性强等优点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

荧光定量 PCR 原理

在 PCR 反应体系中加入荧光基团，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化检测产物量的变化，最终得到得到一条荧光扩增曲线图，扩增曲线横坐标表示循环数，纵坐标表示荧光强度。

一般而言，荧光扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期）、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化；在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数；只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。

实时荧光定量PCR 5大注意事项：

①引物和探针设计不当

为了最高效地设计用于实时荧光定量PCR的引物和探针，我们强烈建议您使用引物设计软件。大多数引物设计程序均包含了可调节的参数以设计最佳的引物和探针。这些参数涉及了引物/探针的Tm值、互补性、二级结构以及扩增子大小等重要因素。另外还建议您限制连续的重复核酸数目。当设计用于真核目标序列的扩增子时，请选择在目标mRNA中至少跨越一个外显子-外显子接合点的PCR引物对，以避免从残留的基因组DNA模板扩增目标片段。

②使用了低质量的RNA

已降解的或低纯度的RNA会抑制反转录效率并降低得率。所用的RNA应当来自于新鲜组织，或者经过RNA稳定试剂处理过的组织，如RNAlater短片段试剂（70–250 bp）等。这样可以避免少部分降解RNA对结果的影响。若无法使用完全完整的RNA，则可以使设计的引物对与感兴趣基因内部区域进行匹配。需要注意的是，对于真正的实时荧光定量PCR，部分降解的RNA可能无法给出基因表达的精确结果。

③未使用“预混液”

qRT-PCR是一种分析RNA的高灵敏工具。由于PCR反应会扩增目的基因，所以误差也会被同时扩增出来。因此，无论何时都应当确保变异处于最低水平。“预混液”是反应试剂的混合液，在设置建立多个反应时应当使用它来最小化样品间和反应孔间的差异以提高可重复性。为了进一步减少孔间差异，可以向预混液中加入ROX等参比荧光。

④引入交叉污染

对PCR区域的所有表面均应当使用DNA去污染试剂来进行日常去污染工作以防止交叉污染，推荐使用如DNAzap?的试剂，其可以破坏DNA。可以使用“无模板对照“（NTC）来排除试剂和实验桌面的交叉污染。NTC含有除RNA模板外的所有RT-PCR试剂。通常是用无核酸酶水简单地替换掉反应中的RNA。反应后NTC中应当没有合成任何产物；若有产物被合成了，则意味着RT-PCR试剂中的一种或多种被扩增产物污染了。

⑤没有正确地设置基线和阈值线

为了得到精确的Ct值，应当在丰度最高的样品所对应Ct值两个循环之前设置基线。为了使实时荧光定量PCR的数据有意义，应当在指数扩增期设置阈值线。典型情况下，阈值应当设置在基线至少10个标准差范围内。

义翘神州提供实时荧光定量PCR技术服务，常用的是SYBR Green qPCR和TaqMan探针qPCR。

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①为您提供SYBR Green染料法和TaqMan探针法，根据您的科研需求进行基因表达分析。

②通过qPCR技术完成定量分析、相对定量分析或绝对定量分析。

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④经验丰富的技术人员设计qPCR检测方案，并提供实验服务。

实时定量PCR分析服务内容：

一、SYBR Green dye法

具体步骤

? 引物设计与合成

? qPCR检测

? 数据分析

交付内容

? 分析报告

? 剩余引物

二、TaqMan探针法

具体步骤

? 引物设计、合成与优化

? 探针设计与合成

? qPCR检测

? 数据分析

交付内容

? 分析报告

? 剩余引物及探针

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