大肠杆菌（Escherichia coli）是第一个用来做重组表达的宿主。原核表达系统具备低成本、高效率、遗传背景清晰及易于扩大等特性，因此在实验室和工业级别生产中均占据重要地位。

义翘神州原核细胞表达平台拥有20+质粒和10+宿主，可提供100+种构建组合方式供客户选择，满足客户对硫键氧化，各种标签等特殊需求。同时实验室拥有多名经验丰富的纯化专家，可以解决各种精纯、复性、挂柱、制剂等工艺问题。下面是关于原核细胞表达的常见问题：

原核细胞表达的常见问题解答：

1、什么情况下建议选择大肠杆菌表达系统？

大肠杆菌表达系统是最常用的蛋白表达系统，优势包括遗传背景清晰、成本低、表达量高、易于放大和时间短等，缺点是容易形成包涵体和无法进行翻译后修饰。该系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白，特别是小分子蛋白。如果您感兴趣的蛋白符合这种情况，建议选择原核表达系统。

2、大肠杆菌能否实现二硫键的正确形成？

未做改造的大肠杆菌形成二硫键的能力较弱，SHuffle T7等针对二硫键形成能力进行过改造的宿主菌，可用于含二硫键蛋白的表达小试。

3、常用的大肠杆菌表达载体都有哪些？

大肠杆菌表达载体种类多样，其中较常见的表达载体有pET系列，携带GST融合标签的pGEX，适合低温下诱导表达蛋白的pCold等。

4、大肠杆菌能否实现蛋白的分泌表达？

原核系统具有一套相对比较特殊的分泌机制，可以通过外分泌信号将蛋白引导富集至周质空间或培养基中，通过溶胀破裂周质空间释放蛋白或直接收集培养基上清液进行下一步的蛋白纯化工作。然而，鉴于大肠杆菌周质空间容积极为有限，且具有较厚细胞壁，分泌表达获得的蛋白产量相对较低。

5、目的蛋白总是以包涵体的形式出现吗？

在原核表达系统中，目的蛋白经常发生错误折叠或表达过快而聚集形成包涵体。目的产物是否会以包涵体形式表达是由多方面因素造成，主要原因有三个方面：

? 目标产物本身的性质不适合

? 原核体系宿主不适合

? 表达条件不适合

6、原核蛋白有哪些纯化方式？如何选择不同的纯化方式？

原核系统表达的蛋白，纯化方式有亲和层析、离子交换、凝胶排阻层析等。亲和层析需要目的蛋白携带融合标签，如His、GST、FLAG等。离子交换和凝胶排阻层析通常适用于精纯或者纯化无标签。

7、如果去除信号肽，会不会影响蛋白本身的表达？

在原核系统表达真核蛋白，信号肽是必需去除的，因为大肠不具备处理此类信号肽的能力，而信号肽的疏水区会增加包涵体的概率。去除信号肽之后在大肠表达是可行的，例如义翘神州的一些细胞因子是去除信号肽之后在原核系统进行表达。

8、如何提高蛋白的可溶性表达？

重组蛋白在原核系统中大量表达时，很容易在胞内形成不可溶的包涵体，为蛋白纯化等下游工作造成麻烦。因此，提高重组蛋白在原核系统中的可溶性表达十分重要。以下三种方法有助于提高目的蛋白可溶性表达：

? 选择融合促溶标签，如SUMO/GST/MBP等。

? 筛选合适的宿主菌进行表达。义翘配备有多种表达菌株，可针对蛋白性质进行选择。

? 改变培养诱导条件

9、如何确定表达的蛋白就是目的蛋白？

从构建环节来讲，构建好的载体要做测序，确保将目的基因导入到表达载体中；从表达过程来讲，可以使用特异性抗体、受体或结合蛋白来进行ELISA或Western blot验证；也可以融合GFP标签，检测荧光强弱。如果想要确定表达过程中氨基酸序列是否完全正确，可以使用最终获得的蛋白进行氨基酸测序或质谱等鉴定实验。

目前义翘神州提供原核（E. coli）蛋白表达服务，同时可以为大家提供原核细胞表达技术平台，如有需求可以详细查看义翘神州网：https://cn.sinobiological.com/services/platform/e-coli-protein-expression