CAR-T细胞制备-慢病毒包装包含哪些?

发布时间:2023/8/16 16:07:00

CAR-T细胞基因转导具有一定的挑战性,慢病毒载体、逆转录病毒载体、转座子和 mRNA 电穿孔技术是较为常见的转导方法,这些技术的进步赋予 T 细胞新的生命力,实现了CAR-T对靶细胞高、精、准的持久杀伤,极大地提高了肿瘤特异性 T 细胞的临床治疗效果。慢病毒载体(Lentivirus,LV)因其宿主范围广、目的基因表达稳定、对哺乳动物细胞具有高感染效率、转基因负荷量更大,可容纳 6.5 kb 外源基因且兼具基因毒性更小等优势,成为了CAR-T细胞构建中最常用的病毒载体。

 

一、慢病毒包装相关产品

 

慢病毒载体是CAR-T细胞构建中最常用的病毒载体。义翘神州为慢病毒包装过程提供全方位的支持:HEK293培养基以及补料液、GMP级核酸酶、核酸酶残留检测试剂盒和HEK293细胞建库及细胞库检测服务、大规模质粒开发服务。

 

①细胞培养基

在慢病毒包装过程中,为了提高慢病毒的安全性,慢病毒载体系统所需的组分被分成三个质粒:VGF、psPAX2、pMD2.G。使用无血清细胞培养基悬浮培养HEK293 细胞达汇合度90%,将三个质粒共转染到HEK293 细胞基因组中。宿主基因组在表达时,随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。

 

义翘神州经过十多年的研发,开发出一系列无血清细胞培养基产品,可用于HEK293 细胞悬浮培养和目标分子表达,培养基生产的整个过程严格按照GMP规范进行管理。所有细胞培养基均为即用型,经过数千种蛋白及抗体表达案例的验证,细胞培养基具有蛋白表达量高、细胞生长好、质控严格、批次稳定性好等特点,已经被多个知名实验室用于细胞培养和蛋白表达研究。

 

②细胞培养基补料液

义翘神州开发的细胞培养基补料液SMS 293-SUPI(Cat#: M293-SUPI)是一种无蛋白,无血清的液体加料液。其仅用于科学研究,不推荐用于人类或动物的诊断和治疗。

 

③细胞转染试剂

利用重组慢病毒载体将表达 CAR 的基因导入并整合到 T 细胞中是一种最常用的 CAR-T 细胞改造方法。义翘神州拥有高品质的转染试剂 Sinofection? Transfection Reagent (Cat#: STF02),细胞毒性小、重复性高,可用于慢病毒载体的高效转染,转染效率基本可以达到95%以上。

 

二、核酸去除及检测相关产品

利用慢病毒进行CAR基因转导T细胞的过程中会产生核酸残留,这些核酸残留物具有潜在的危害性。残留的核酸可能会在人体内造成细胞增殖失控,变为肿瘤细胞。核酸残留可能存在感染性病毒基因,增加体内免疫反应。因此,利用核酸酶进行有效的核酸残留去除,是非常重要的。同时,核酸酶在慢病毒包装过程中同样不能有残留,所以在使用核酸酶去除核酸后,还需要对核酸酶进行清除,并进行检测,确保产品符合生产标准要求。北京义翘神州开发高品质的GMP级备案核酸酶(Cat#: GMP-SSNP01),用于去除慢病毒扩增过程中的DNA污染。同时,我们还提供高性能配套的核酸酶残留检测试剂盒(Cat#: KIT-SSNP01),可用于检测和定量分析样品中的核酸酶残留量,具有灵敏度高、特异性好、通用性等优点。义翘神州的高质量核酸去除及检测产品为CAR基因转导解决核酸残留的困扰。

 

义翘神州提供GMP级条件下生产的全能核酸酶Super Nuclease(Cat#: GMP-SSNP01),无动物源性,可高效降解单链、双链、线性、环状、超螺旋等任何形式的DNA及RNA。超高活性,应用场景广泛且使用量低不易残留,质量、性能、供货能力可靠,并已完成在FDA的药物主文件申报备案(DMF Number#:35978),满足药物申报的规范。

 

三、细胞库检测

 

在进行慢病毒包装过程中,需对共转染前的宿主HEK293 细胞进行微生物安全风险检测。HEK293 细胞的微生物安全风险可能涉及细菌、真菌、支原体、外来病毒等污染。微生物安全问题需要高度关注,因为在生产过程中很容易发生微生物污染,最终导致细胞产品无法净化。义翘神州细胞库检测实验室为生物安全二级实验室,已在北京市备案,且通过CNAS认证。该实验室按照GMP和GLP质量体系运行,B+A环境,满足无菌检测、分枝杆菌检测环境要求。

 

四、慢病毒包装质粒生产

慢病毒载体是由三个包装质粒和一个表达质粒(也称穿梭质粒)瞬间共转染293T细胞,通过克隆筛选获得稳定组装表达高滴度慢病毒载体的细胞株,经发酵纯化后获得一定质量要求的慢病毒。慢病毒载体可以将CAR基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达CAR基因的目的。义翘神州能够提供快速、高通量、高品质以及个性化的慢病毒包装质粒制备服务,满足实验室研究人员的小量慢病毒质粒制备需求。

 

例如:质粒DNA制备服务

义翘神州升级改造后的慢病毒质粒制备平台,采用GMP级别的生产线,对过程和最终产品的严格管控,确保了最终产品质量符合客户需求。义翘神州可以提供从μg级别,mg级别至g级别不同规模的科研级质粒生产服务,满足不同的需求。

 

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