稳转细胞系即稳定表达细胞系，即目标基因表达元件（过表达元件、干扰shRNA元件）整合在宿主基因的基因组中，随着细胞传代可以稳定的表达，稳转细胞系构建主要有几种方案：

一、慢病毒感染细胞；

慢病毒因为可以感染大多数的分裂细胞和非分裂细胞，包装技术成熟，II代和III代慢病毒包装系统均能包装高滴度的慢病毒，是稳转细胞系构建的首选系统。但是因为慢病毒有包装容量限制，不适合转录本区域比较长的基因，对较大的基因有局限性。另外由于慢病毒是逆转录病毒，病毒表达载体中，是由WPRE元件代替PolyA稳定以达到稳定mRNA的作用，对部分基因的翻译有一定影响。

二、转座子介导的稳转细胞系构建；

转座子（Transposon）也称“跳跃基因”，由美国科学家芭拉拉·麦克林托克在研究玉米颗粒颜色时发现。是普遍存在于各种生命细胞内的可移动的遗传信息元件，通过“剪切和粘帖”机制实现DNA片段在染色体内部/之间高效转移。工程化的转座子是由两部分组成，包括位于转座子基因两侧的顺式元件短末端反向重复序列（ITR）和位于两个ITR序列之间的转座酶编码基因序列。转座子是通过编码转座酶，转座酶与ITR序列结合介导转座酶基因在基因序列之间的转移。将转座子的两个元件分离并构建在两个独立在载体上，原来转座酶的序列替换成感兴趣的基因序列（GOI），而转座酶在另外一个载体上独立表达，将两个载体共转染目的细胞，就能实现目的基因在宿主基因组上整合，与其他技术的不同（慢病毒载体介导的基因组整合），在整合酶存在的情况，目的基因会一直处于切割—整合的状态，即连续在基因组上跳跃。

转座子载体设计结构图转座子稳转细胞系主要的优势是其对基因大小没有严苛的限制，文章报道最多可以实现200kb的基因插入，另外，随着睡美人转座子系统的不断优化，转座子插入效率提高了100倍以上，整合效率与慢病毒效率相当。缺点是因为转座子系统为了达到更好的整合效率，一个目的基因的拷贝大约需要4个睡美人转座子SB100x转座酶，所以转座酶和目的基因是单独的骨架载体，依赖于细胞的质粒转染效率，对于原代细胞、难转染的细胞等有一定限制。随着SB100X转座酶I212S和C176S两个突变位点的改进。改变的转座酶的稳定性，溶解性，显著降低了转座酶被纯化为具有活性重组蛋白的的技术难度。通过引入这两个突变，创建了一种新型的转座酶突变体，可以通过RNP的方式将转座酶和目的基因表达载体电转细胞，实现高效率的整合。但是通过转座子RNP的方式进行稳转株的构建，对设备提出了更高的要求。

三、CRISPR/Cas9基因敲入

采用CRISPR/Cas9系统进行目的基因（外源基因，抗性基因和荧光标志等）的定点敲入，是通过提供外源模板（Donor载体）依靠细胞自身的修复机制NHEJ（非同源末端连接）和HDR（同源同组）完成的。在哺乳动物细胞中，CRISPR/Cas9介导的NHEJ对标记基因的插入概率明显高于HDR修复机制。

利用CRISPR/Cas9基因敲入构建稳转细胞系，通过设计人PPP1R12C基因的第一个内含子上（AAVS1位点，人基因组安全港）位点sgRNA和donor载体，利用不同的递送系统递送目的细胞，实现gRNA位置的基因定点敲入。在该位点中插入外源基因片段具有稳定表达、不影响其他基因转录的优点。相对于慢病毒和转座子系统，基因敲入方法是基因定点插入，细胞基因型一定，不存在随机插入的风险。但基因敲入的概率不同细胞，不同位点差异较大，并且需要挑取单克隆以得到基因型一定的稳转细胞克隆株。随着基因编辑效率的不断提高，利用AAVS1位点基因敲入构建稳转细胞系会越来越省时省力。

细胞稳转细胞系构建中常见问题：

1.是否需要进行密码子优化？

由于氨基酸密码子的简并性和tRNA的种类多样性、数量的差异，密码子优化对长基因稳转细胞系的构建有很强的必要性，可以大幅提高目标蛋白的表达量。

2.Kozak序列是必须要添加的吗？

Kozak序列（通常是GCCACCatgG），真核生物mRNA真正的起始密码子位于Kozak序列的保守序列中，其共有序列是CCRCCAUGG，几乎所有mRNA的翻译起始都依赖于5’帽子结构募集小亚基，少数通过内部核糖体进入位点(IRES)募集小亚基。Kozak序列通过与翻译起始因子eIF形成翻译起始复合物，起始蛋白的翻译。

3.启动子的选择

CMV（巨细胞病毒）启动子除了在干细胞外，其他大多数细胞类型中均可以获得高表达活性。悬浮细胞中SFFV启动子表达活性相对较高。而EF1a（延伸因子-1α）启动子更适用于表达长片段的基因。CMV；EF1A；CAG；CBh；SFFV，等均属于强启动子，都可作为稳转细胞系构建可选启动子。

4.稳转细胞系培养体系

稳转细胞系一般建议用半抗性筛选浓度维持细胞生长，如hepG2细胞puro抗性筛选浓度为2μg/ml，则建议用1ug/mL+完全培养基维持生长；部分基因过表达后会影响细胞代谢，尤其肿瘤细胞，糖酵解代谢速率受影响，细胞生长缓慢，可相应添加葡萄糖或者HEPES调节细胞细胞代谢水平，维持细胞增殖。

5.标签放在N端还是C端好？

如果N端有信号肽，建议放在C端；蛋白如果较小，建议放在C端，减少蛋白降解；如果下游有P2A，T2A等自剪切肽，建议放在C端。如果为了添加Kozak序列，建议加在N端。如果纯化中需要酶切标签，建议放在N端。

6.是否可以构建稳转敲除的细胞系？

一般不建议，因为敲除元件稳定持续的表达在细胞中，累积脱靶效应明显，影响细胞状态。

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