稳转细胞系构建中常见问题：

1. 是否需要进行密码子优化？

由于氨基酸密码子的简并性和tRNA的种类多样性、数量的差异，密码子优化对长基因稳转细胞系的构建有很强的必要性，可以大幅提高目标蛋白的表达量。

2. Kozak序列是必须要添加的吗？

Kozak序列（通常是GCCACCatgG），真核生物mRNA真正的起始密码子位于Kozak序列的保守序列中，其共有序列是CCRCCAUGG，几乎所有mRNA的翻译起始都依赖于5’帽子结构募集小亚基，少数通过内部核糖体进入位点(IRES)募集小亚基。Kozak序列通过与翻译起始因子eIF形成翻译起始复合物，起始蛋白的翻译。

3. 启动子的选择

CMV（巨细胞病毒）启动子除了在干细胞外，其他大多数细胞类型中均可以获得高表达活性。悬浮细胞中SFFV启动子表达活性相对较高。而EF1a（延伸因子-1α）启动子更适用于表达长片段的基因。CMV；EF1A；CAG；CBh；SFFV，等均属于强启动子，都可作为稳转细胞系构建可选启动子。

4. 稳转细胞系培养体系

稳转细胞系一般建议用半抗性筛选浓度维持细胞生长，如hepG2细胞puro抗性筛选浓度为2μg/ml，则建议用1ug/mL+完全培养基维持生长；部分基因过表达后会影响细胞代谢，尤其肿瘤细胞，糖酵解代谢速率受影响，细胞生长缓慢，可相应添加葡萄糖或者HEPES调节细胞代谢水平，维持细胞增殖。

5. 标签放在N端还是C端好？

如果N端有信号肽，建议放在C端；蛋白如果较小，建议放在C端，减少蛋白降解；如果下游有P2A，T2A等自剪切肽，建议放在C端。如果为了添加Kozak序列，建议加在N端。如果纯化中需要酶切标签，建议放在N端。

6. 是否可以构建稳转敲除的细胞系？

一般不建议，因为敲除元件稳定持续的表达在细胞中，累积脱靶效应明显，影响细胞状态。

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