融合蛋白表达载体的构建过程及融合蛋白作用有哪些?

发布时间:2023/6/30 16:34:00

融合蛋白(fusion protein)有两种不同的含义,一种是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物,另一种是介导两个细胞质膜融合的一组蛋白,如在仙台病毒脂双层外侧小叶中含有的两种糖蛋白之一,介导病毒被膜与宿主细胞质膜的融合作用。另一种糖蛋白是血细胞凝集素神经酰胺酶。 两个不同的蛋白质既可以通过化学方法也可以通过基因的融合来连成一个大分子。

 

大体上有两种类型的融合蛋白:第一种是由两个蛋白或蛋白亚单位端对端融合,通常由一个linker连接,第二种是来自两个供体的氨基酸穿插在融合蛋白产物中。

 

融合蛋白的特点:

 

融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。

原核表达系统的特点是时程短,费用低,是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰;大量蛋 白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物,需要复杂的变性和复性过程;大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多,甚至可被改造成人源型;真核细胞易被转染,具有遗传稳定性和可重复性;产物可被分泌,提纯简单,成本低。

 

 

融合蛋白表达载体的构建过程:

一:准备载体 融合蛋白表达载体的设计首先需要准备一个载体,载体可以是基因组DNA,基因的cDNA或者是其他可以表达目标基因的DNA片段,如遗传可变的质粒。

2.

二:确定编码区 需要从基因组DNA、cDNA或者是其他载体(如质粒)中确定出编码目标基因的编码区,这一步一般是靠PCR扩增。

 

三:筛选表达元件

 

四:构建融合蛋白表达载体

 

五:植入细胞中和进行表达

 

六:确定表达结果

 

重组融合蛋白是由两个或多个原本编码不同蛋白质的基因组合而成。从融合基因翻译而来的含有单个或多种多肽的重组融合蛋白获得了源于每个原始蛋白的功能特性。

 

重组融合蛋白有哪些用途?融合蛋白有三大最重要的用途:

? 作为克隆基因纯化的辅助工具

? 作为报告基因,检测蛋白的表达水平

? 作为组织化学标签,使蛋白在细胞、组织或生物体中的位置可视化

 

在重组蛋白纯化中,重组融合蛋白常用于亲和色谱中,可以简便地将纯化的蛋白与研究人员希望研究的蛋白连接起来。许多蛋白和肽被已用作融合标签,包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST 标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP 标签)、多聚组氨酸(His 标签)、人生长激素、泛素和抗体表位。另外,β-半乳糖苷酶、荧光素酶和绿色荧光蛋白 (GFP) 通常作为伴侣蛋白表达和位置的报告者。

 

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