蛋白纯化是生物实验室和制药工业中至关重要的技术。它涉及从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，同时保持蛋白质的结构和功能。了解蛋白纯化的原理和步骤不仅有助于提高实验效率，还可以降低实验失败的风险。在本篇文章中，我们将详细介绍蛋白纯化的定义、原理和步骤。

蛋白纯化定义及原理

蛋白纯化是生物研究常用的一种技术，是指从蛋白混合物中得到纯度较高的某种蛋白的过程。根据样本和杂质的特性选择适合的纯化方法，纯化技术的选择要简单化，并且要产生最佳的纯化效果。如果纯度的要求很高，再增加一个离子交换或疏水作用色谱的额外中间步骤。不过尽量尝试使用尽可能少的步骤，因为步骤增多会降低总蛋白产出量。亲和步骤常用重力柱，有时其他色谱步骤中会使用恒压泵，然而蛋白纯化系统将提供更多的控制，可获得更详细的目标蛋白和杂质信息，并为色谱柱提供更好的保护。

可溶性蛋白纯化的步骤

用于分离可溶性重组或非重组蛋白的分离方法取决于蛋白的内在生理化学特性（被标记蛋白除外）。典型的纯化方案如下所示（使用离子交换色谱法）。

1、细胞裂解液

澄清裂解液

离心（>60000×g，90 分钟）过滤或脱盐和交换缓冲液

2、澄清裂解液

①用亲和法

（1）进行DEAE-Sepharose离子交换

交换缓冲液

（2）进行离子交换

? 弱阳离子-羧甲基

? 强阳离子-甲基磺酸盐

? 强阴离子-季铵盐

? 弱阴离子-二乙氨基乙基

? 磷酸纤维素

（3）用其他色谱方法

? 染料基质

? 疏水

? 羟磷灰石

? 层析聚焦

②浓缩

③进行凝胶过滤

④无菌过滤

3、经纯化的蛋白

包涵体蛋白的折叠与纯化

在大肠杆菌中表达的重组蛋白位于细胞裂解后低速颗粒部分，它们高度聚集。包涵体通常来自于细胞质（或细胞周质，如使用了分泌载体）中的蛋白聚集。如前所述，由于与细菌核酸的相互作用，蛋白也可以位于低速或高速颗粒部分中。

采用蛋白变性剂提取蛋白，如盐酸胍(Gu·HCl)、尿素或有机酸。使用还原剂二硫苏糖醇(DTT)防止人工二硫键形成（尤其是分子间键）。变性后的蛋白可以通过各种方法纯化后再折叠，也可以直接折叠。通常建议在折叠前进行一些纯化（如Gu·HCl中的凝胶过滤），因为这往往会带来更高的折叠产率。