基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。但传统的方法需要使用单链DNA 模板，而得到单链DNA 模板又需要先将基因克隆到类似M13 这种载体中，操作过程冗长。为了克服这些缺点，本公司将突变位点设计到一对互补的引物中，用高保真扩增质粒模板，然后用Dpn I 去除原始的甲基化模板，新合成的DNA 通过互补形成带切口的双链质粒，直接用于转化感受态细菌。

本产品具有下列特点：

1. 直接使用质粒DNA 作为模板，免去了制备单链DNA 的步骤。

2. 基于高保真PCR，对模板DNA 序列没特殊要求，可以用于突变任何序列。同时对模板的需求量很少。

3. 一管式，全部在一个优化的缓冲体系中完成，非常简单。

4. 使用Dpn I 去除未突变模板，突变效率高达90%。

5. 可用于制备点突变，缺失突变和插入突变。

6. 本产品A 型适用于8 kb 一下，B 型适用于8-15 kb。

低温运输、-20℃保存, 有效期一年。

使用方法：

一、引物设计及注意事项

用于特定基因突变的引物必须用户单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计。

1. 共需设计两条完全互补的一对引物，它们覆盖要扩增的突变区位点，突变位点放在引物的中心。可以先集中设计一条，然后就可得互补的另一条引物。

2. 引物的长度通常为25-45 个碱基。引物中突变位点任何一侧都必需满足Tm 大于45 的条件，Tm 计算方式为Tm=4×(GC 碱基数)＋2×(AT 碱基数)。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就达到此标准，它的突变位点AAG 所放位置使左侧Tm＝46；右侧Tm＝48，均大于45。

3. 尽量把引物的GC 含量控制在40％-60％，结尾的1-3 个碱基是G 或C。

4. 尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。

5. 使用经过PAGE 纯化的引物或更高纯度的引物。

二、待突变模板质粒的选择

1. 必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变，否则Dpn I 不能把没有酶切的质粒DNA 切除，产生大量的假阳性。常用的大部分大肠杆菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109 等。

不能使用JM110 和SCS110 以及其它dcm-菌种。

2. 待突变质粒和目的基因的GC 含量应该在40-55％，没有任何GC 含量超过70%、长度在50bp 以上的区域。如果质粒GC 含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。如果目的基因GC 含量过高，而突变位点不在高GC 含量区域，可以先把该基因的不含高GC 含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果突变位点在高GC 区，则可以使用高GC 专用PCR 反应试剂。

三、基因定点突变反应

1. 在一个塑料离心管中加入下列成分

2. 加入1 uL 高保真DNA 聚合酶，混匀，如果PCR 仪没有热盖则需要加少量石蜡油。

四、Dpn I 消化：

PCR 反应后，直接在PCR 反应体系中加入1uL Dpn I 内切酶（该酶在甘油保存液中会下沉到管底，故用前需要充分混匀）。DpnI 可以酶切双链都被甲基化的模板质粒，也能降解一条链被甲基化的双链质粒。混匀后37℃孵育2 小时后样品可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。

五. 转化、挑克隆鉴定：

每100 微升感受态细菌（转化效率必须在107 /ug 以上）中可以加入5-10 微升经过Dpn I 消化后的突变产物，按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作。如果PCR 使用了石蜡油，在转化时千万别把它带入转化反应，否则会严重影响转化效率。

在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌全部涂布到含有适当抗生素的平板上培养过夜。通常会得到50 个以下的克隆，可按常规方法制备质粒并测序。

六、常见问题：

1. 转化后没有克隆或克隆数极少：

(1) 感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在107 /ug。

(2) 把Dpn I 消化后的产物用常规的乙醇沉淀浓缩，这样就可以把所有的产物全部用于转化。

(3) 优化基因定点突变中的PCR参数。可以把最初的95℃变性时间延长为2 分钟，循环中95℃变性的时间延长至1 分钟，把循环中的68℃的延伸时间改为1.5 分钟/kb 至2 分钟/kb，退火可以改为60-55℃或65-55℃等的touch down，退火时间也可以适当延长。

(4) 引物设计有问题。通过突变反应中的PCR 没有很好地扩增出预期的突变质粒。

2. 有克隆，但没有或很难检测到预期的突变克隆：

(1) 使用的待突变的模板质粒量过多，导致Dpn I 消化时不完全，可减少质粒用量。

3. 有突变克隆，但突变位点不是预期的位点：

(1) 引物设计不佳，退火温度过低，

导致引物退火到错误的地方。

(2) 引物质量较差，没有经过PAGE 纯化。这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引物，容易导致非预期的突变。