柱式无内毒素质粒DNA提取试剂盒说明书

发布时间:2017/5/9 16:34:00

产品特点:

本产品是整合我们公司柱式质粒DNA提取和菌体内毒素清除剂两产品而成。菌体内毒素清除剂是我们公司推出的产品,在质粒提取前就把细胞壁上的内毒素清除掉,彻底避免了目前通用的先提取DNA+内毒素混合物,再从中纯化质粒DNA的弊端。用本产品提取的质粒DNA,内毒素的污染浓度低,适合于转染等对内毒素的污染敏感的实验。

1. 操作简单,只在经典的柱式质粒DNA提取前,增加菌体内毒素清除一步。

2. 去内毒素效果好,处理可以去除99%以上的内毒素。

3. 质粒丢失少,产率只比柱式质粒DNA提取低5-10%,效果好于先提质粒DNA,再用液相内毒素清除剂处理的方法。

4. DNA可以直接用于转染等实验。

常温运输及保存,有效期一年。RNase A(10mg/mL)需要低温运输和保存。

使用方法:

一: 用菌体内毒素清除剂清除E.coli细胞壁上的内毒素。

1. 收集1.5-3 mL E.coli饱和菌液,12,000 rpm离心1分钟,弃上清,得到细菌沉淀。

2. 加入1 mL本产品温和混匀后10,000-12,000 rpm离心1分钟,弃上清(含内毒素)。

3. 再重复上述操作3-4次,得到的菌体可以直接进入后续的质粒DNA提取步骤。

二:从无内毒素的E.coli中提取质粒DNA

1. 用1.5 mL离心管收集1-4 mL 过夜培养饱和菌液,12,000 rpm离心1分钟,弃上清,再短暂离心,吸弃残留液体。

2. 加入250 uL溶液A,用枪头充分吹打使菌体重悬。

3. 加入250 uL溶液B(如果有沉淀,用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用),温和反复颠倒混匀4-6次,看到溶液变粘即可。千万不要剧烈振荡。

4. 加入350 uL溶液C,反复颠倒混匀4-6次,可见白色沉淀物产生,然后冰上静止2-5分钟。注意:不要超过5分钟。

5. 室温12,000 rpm离心10分钟,将上清液转移到离心吸附柱中,室温放置2分钟。

6. 12,000 rpm离心1分钟,质粒DNA吸附到膜上,弃收集管中的废液。

7. 加入500 uL的通用洗柱液,12,000 rpm离心1分钟,弃收集管中的废液。注意:我们公司的通用洗柱液是由乙醇和含NaCl的溶液组成,NaCl在其中的溶解度较低,放置一段时间后可能会产生NaCl沉淀。如果有沉淀,用前加热使之溶解并混匀后使用。

8. 重复上步操作1次。

9. 12,000 rpm离心1分钟,甩干残留液体。此步不能省略,否则残留乙醇会影响后续的电泳上样(DNA沉不到加样孔里去)和酶反应。

10. 将离心柱置于新的1.5 mL离心管(自备)中,加入50 uL DNA洗脱液2.0,室温放置2分钟。

11. 12,000 rpm离心1分钟,离心管底溶液即质粒DNA。

12. 由于天我们公司的吸附柱结合DNA能力较强,需要再加入50 uL DNA洗脱液2.0到离心吸附柱中,室温放置2分钟,重复上步操作,往往还能洗脱下很多质粒DNA(相当于次洗脱的20-30%)。注意不要使用上步得到的含有DNA的洗脱液来进行第二次洗脱。

13. 将两次洗脱收集到的质粒DNA汇集即可立即使用或放冰箱保存。