产品特点：

叶绿体是重要的，负责植物光合作用的细胞器，很多重要的特性(如雄性不育)也跟叶绿体相关，所以叶绿体是研究植物生理和母系遗传的重要材料。对植物叶绿体进行生化，遗传和分子生物学研究都需要进行叶绿体纯化。本产品就是基于密度梯度离心的，专门用于从植物叶片中纯化完整叶绿体的试剂盒。它具有下列特点：

1. 即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。

2. 提供AB两种选择，A型用于叶绿体粗提，所得叶绿体含少量其他细胞器污染，可用于后续的SDS-PAGE，Western，ELSIA和蛋白组分析。B型用于叶绿体精提，所得叶绿体完整，可用于后续的光合作用，电子链和磷酸化，跨膜转运，体外叶绿体蛋白合成，蛋白定位等研究。还可用于的叶绿体膜，基质，类囊体，叶绿体DNA和叶绿体RNA纯化。

3. 本产品足够15次提取，每次可处理30g叶片，能得到5 mg左右叶绿体。

4. 已经成功用于菠菜，大豆，莴笋，白菜，烟草和甜菜等植物，还可用于更多植物（可能需要优化条件）。

保存条件：

常温运输，4℃保存, 保存期限一年。

使用方法：

注意：叶绿体对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用器皿和溶液均需要在4℃预冷。离心时一定要在4℃进行，离心力以g而不是rpm计算。如果需要研究叶绿体的功能，提取过程还需要在昏暗的光线条件下进行。

1. 实验前1-2天将植物放在暗室培养以减少叶绿体中淀粉颗粒的形成，否则离心时这些颗粒很容易使叶绿体破裂。叶片在实验前需先用自来水洗净，再用蒸馏水淋洗，去掉多余水分。如果叶片采集后不能立即处理，则保存时需要保持叶片湿润，即使如此，叶片的放置时间也不能超过一天。

2. 新鲜（实验当天）制备溶液A：将自备的去离子水与溶液A成分一按4：1的比例混合，然后在混合液中加入溶液A成分二干粉到终浓度0.1%（每100 mL

中加入0.1 g干粉），摇晃溶解后所得溶液即为溶液A，冰上预冷待用。实验（从30 g叶片提取叶绿体）所需要的溶液A体积跟材料不同而不同。

3. 新鲜采集植物叶片，快速去除叶脉并将叶片剪成1-3 cm2大小的碎片并浸泡在适量的预冷的溶液A中（每克叶片加4 mL溶液A，但对烟草和大豆，每克叶片需要加6 mL溶液A）。

4. 将浸泡了叶片的溶液A转移到Waring匀浆机（即家用制备果汁的匀浆机）中，低速匀浆10秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入匀浆机底部后，再低速匀浆10秒。注意：除Waring匀浆机外，还可以选择Dounce玻璃匀浆器，Polytron匀浆机和研磨（加玻璃珠）等裂解细胞的方法，但这些方法的单次处理量都比较小，需要将样品分成很多小份单独匀浆，然后再汇集。

5. 用带柄尼龙滤膜过滤匀浆液，可先将滤液收集到预冷的200 mL量筒中，再等分到4个预冷的50 mL的塑料离心管中（每个管中的滤液不要超过35 mL）。带柄尼龙滤膜后可反复使用。

6. 在水平转子离心机上4℃ 200 g离心3分钟（对菠菜，白菜和莴笋材料）或400 g离心1分钟（对甜菜材料），白色沉淀为未破裂的细胞或细胞核。

7. 将上清液（含叶绿体）转移到一个新的、预冷的50 mL塑料离心管中。

8. 在水平转子离心机上4℃ 1000 g离心7分钟，小心弃上清，沉淀含叶绿体，呈浅绿色。

9. 在沉淀中加入1.5 mL预冷的溶液A，手弹离心管底部使叶绿体重悬。注意：重悬时避免溶液起泡，也不要用枪头吹打，否则叶绿体容易破裂。沉淀下有白色淀粉属于正常现象，但重悬叶绿体时避免将白色淀粉重悬。

10. 将4管叶绿体重悬液汇集（共约6 mL）。此溶液为叶绿体粗提产物，可直接用于后续的SDS-PAGE，Western，ELISA和蛋白组分析。如果需要以之为材料精提叶绿体，就需要将破裂的叶绿体和完整的叶绿体分开，根据植物的不同，可选用下述两种密度梯度离心法之一进行分离。

11. 单浓度分离法（适合菠菜，白菜和莴笋等材料）：

a) 在50 mL塑料离心管中先加入6 mL溶液A成分一和4 mL 溶液B，充分混合均匀。

b) 在其液面上小心铺上第11步汇集得到的约6 mL叶绿体重悬液。

c) 在水平转子离心机上4℃ 1000 g离心8分钟，最上层的绿色带含破碎的叶绿体，线粒体和核糖体等，管底的绿色沉淀为完整的叶绿体。

d) 小心将上清倒出后，在叶绿体沉淀中加入预冷的0.5 mL溶液A成分一，手指轻弹管底使之重悬。

e) 将叶绿体重悬液转移到1.5mL离心管中并避光保存。可在相差显微镜下检查叶绿体完整性。叶绿体必须尽快使用，否则非常容易失去活性。

12. 双浓度分离法（适合烟草，甜菜和大豆等材料）：

a) 在14 mL塑料离心管中先加入0.5 mL溶液A和2 mL 溶液B，充分混合均匀，得密度梯度重液。

b) 在另一试管中将3 mL溶液A和2 mL 溶液B充分混合均匀，得密度梯度轻液。

c) 将密度梯度轻液小心铺在密度梯度重液之上，然后将第10步汇集得到的叶绿体重悬液中的4 mL(还剩下2 mL)小心铺在密度梯度轻液之上。

d) 在水平转子离心机上4℃ 3200 g离心15分钟，最上层绿色带含破碎的叶绿体、线粒体和核糖体等，重液和轻液间的绿色带为完整叶绿体。

e) 用广口吸管小心将重液和轻液之间的绿色带（叶绿体）转移到新的离心管中，加入三倍体积的预冷的溶液A成分一，轻柔混匀。

f) 在水平转子离心机上4℃ 1700 g离心1分钟，小心将上清倒出后，在绿色的叶绿体沉淀中加入预冷的0.5 mL溶液A成分一，手指轻弹管底使之叶绿体重悬。

g) 将叶绿体重悬液转移到1.5 mL离心管中并避光保存，也可在相差显微镜下检查叶绿体完整性。叶绿体必须尽快使用，否则非常容易失去活性。所得精提叶绿体可用于后续的光合作用，电子链和磷酸化，跨膜转运，体外叶绿体蛋白合成，蛋白定位等研究。还可用于的叶绿体膜，基质，类囊体，叶绿体DNA和叶绿体RNA纯化。