产品特点：

本产品是甲基化专一性PCR 试剂盒（BTN100923）的升级版，其亚硫酸氢盐DNA 修饰试剂盒（BTN100922）的升级版，亚硫酸氢盐修饰DNA时要求DNA 必须在单链状态，反应还必须在低温进行，常规的修饰试剂盒由

于是在液相进行，要在低温下让DNA 不相互复性而保持单链状态非常棘手，所以常规修饰试剂盒的修饰效率一般都不高。此外，常规方法要切换反应液，有多次沉淀步骤，使得DNA 的回收率一般都不超过50%。为克服这些缺点，本公司开发出了此升级产品，它具有下列特点：

1．用包埋的样品进行所有操作，免去所有沉淀和纯化步骤，极大简化了操作。

2．免去了DNA 提取过程，所需实验材料比常规方法更少，最少几个细胞都可以，极大地节约了宝贵材料，尤其适用于珍稀材料。

3．包埋处理后，DNA 在整个操作过程中都处于最适于修饰的单链状态，极大提高了修饰效率。

4．DNA 包埋于包埋块中，切换反应液非常方便，而且DNA 不会丢失，所以最终回收率都在90%以上。

5．适用于实体材料、悬浮细胞和纯化好的DNA 样品。

6．本试剂盒提供的甲基化修饰试剂盒足够制备150 多个10uL 包埋块（如果用纯化好的DNA）或25 个10uL 包埋块（如果用悬浮细胞）；本试剂盒提供的PCR 试剂盒足够180 次100uL 体系的PCR 反应。

常温运输及保存, 保存期一年。但Proteinase K 和即用型PCR Mix3.0 需要低温运输，-20℃保存。

使用方法：

一：准备试剂

1. 在装有2.3g 溶液B 成分一干粉的瓶中加入3.9 mL 水和0.9 mL 溶液A，摇晃溶解得到4.8 mL 溶液B 成分一。在装有110mg 溶液B 成分二干粉的离心管中加入1 mL 50℃预热的超纯水，摇晃溶解，得到溶液B 成

分二。将0.6 mL 溶液B 成分二加入到4.8 mL 溶液B 成分一中，得到5.4 mL 溶液B，冰上放置待用。未用完的溶液B 下次不得再使用。

2. 每次实验前，将装有1.5 mL 包埋液离心管在沸水浴上放置数分钟直到变成溶液，然后放80℃待用。

二、对微量组织材料（如果材料足够，可先纯化DNA，再按第三方案进行）1. 用常规的胰酶消化法处理动物实体组织或培养细胞，得到浓度不超过60细胞/uL 的单细胞PBS 悬液。如果实验材料已经是单细胞悬浮液（如卵细胞），则PBS 洗涤后直接离心沉淀，再重悬在PBS 中（浓度不超过60细胞/uL）。注：本试剂盒不含本步所需相关试剂。

2. 在一个2 mL 离心管中加入3 uL 细胞悬液，再迅速滴加7 uL 在80℃预热的包埋液。注：不需要吹打混匀以免混合液在抢头里面凝固。

3. 加入500 uL 分子生物学级石蜡油，将离心管在沸冰浴中放置20 分钟。

4. 将离心管转移到冰上放置30 分钟，低温下包埋液和细胞混合液将凝固成10uL 的包埋块。

5. 加入500 uL 包埋块裂解液和5 uL Proteinase K 溶液，37℃保温过夜。

加入的溶液比重都比石蜡油大，将会自动沉降到石蜡油下层，不需离心。

6. 吸弃包埋块之外的所有溶液（包括石蜡油），用1mL TE 缓冲液室温浸泡包埋块2 次，每次15 分钟。此步可去除残留包埋块裂解液。

7. 酶切包埋块中的DNA：选定不识别PCR 靶片段的内切酶（本试剂不提供该相关试剂），再用100 uL 选定内切酶的1×缓冲室温液浸泡包埋块15 分钟，吸弃缓冲液后再加入100 uL 选定内切酶的1×缓冲液和50U

选定的内切酶，37℃保温2 小时。

8. 吸弃酶切反应液，再加入500 uL 新鲜配制的处理液A（配制方法：100uL 溶液A+400 uL 超纯水）室温放置15 分钟，重复此步。此时DNA 将呈单链。

9. 吸弃处理液A，用1 mL 新鲜配制的处理液B（配制方法：50uL 溶液A+950 uL 超纯水）室温浸泡包埋块5 分钟。

10. 吸弃处理液B，加入750uL 石蜡油，然后沸水浴20-30 秒，使DNA 单链彻底彼此分开。

11. 奖离心管转移到冰上放置30 分钟使包埋块重新凝固。

12. 在离心管中加入1mL 预冷的溶液B，溶液B 将自动沉降到石蜡油下层。继续在冰上放置30 分钟。此步用于修饰单链的DNA。

13. 将离心管转移到50℃放置3.5 小时。

14. 吸弃溶液B，用1mL TE 缓冲液常温洗涤包埋块2 次，每次15 分钟。

15. 吸弃TE 缓冲液，用500 uL 新鲜配制的处理液C（50 uL 溶液A+450 uL超纯水）常温洗涤包埋块2 次，每次15 分钟。

16. 吸弃处理液C，用1 mL TE 缓冲液常温洗涤包埋块3 次，每次10 分钟.

17. 吸弃TE 缓冲液，所得包埋块可以在4℃保存数月待用，也可以用超纯水洗涤两次（每次15 分钟）后直接用做100uL 体系甲基化PCR 的模板。

三、对纯化好的DNA

18. 选用不识别PCR 靶片段的合适内切酶酶切纯化的基因组DNA（本试剂不提供所需试剂），总体积不超过20uL，基因组DNA 不超过700 ng。

19. 酶切结束后，沸水浴5-10 分钟灭活内切酶并变性DNA。

20. 冰上放置并短暂离心数秒后，再加入4 uL 溶液A，50℃保温15 分钟。

21. 迅速加入50 uL 在80℃预热的包埋液，用手指快速弹击管底混匀溶液并继续放80℃待用。不要吹打混匀以避免包埋液在移液枪头中凝固。

22. 在一个新的、2 mL 离心管中，加入1 mL 预冷的溶液B，再加上750 mL石蜡油，并将离心管放冰上预冷。

23. 迅速取80℃保温的混合液10uL，用在空中滴加的方式加到上步准备的预冷的离心管中，滴加的混合液遇冷将迅速在石蜡油中形成包埋块并自动沉入管底。注意：不要将枪头浸入到预冷的溶液中，否则包埋液将迅速在枪头内凝固。如果包埋块没有沉到管底，可以用枪头将其拨到石蜡层下面的液相中。

24. 再重复上步操作，共可以得到7 个包埋块（约含100ng DNA）。

25. 将离心管（含7 个包埋块）继续放冰上30 分钟进行修饰。

26. 后续操作同第13-17 步。

四、甲基化专一性PCR（由于包埋块可能会抑制PCR，所以使用100 uL体系的PCR 进行甲基化检查，如果效果不好，建议使用巢式PCR）

27. 在一干净的PCR 管中，加入下列成分

28. 将混合物混匀，放入PCR 仪中进行热启动PCR，结束后取5-10 uL PCR产品直接进行琼脂糖电泳。