线粒体是非常重要的细胞器，它不但跟很多人类疾病相关，而且还是母系遗传研究的重要材料。对线粒体进行遗传研究和生化研究都需要纯化线粒体。本产品可用于纯化动物细胞线粒体的试剂盒。它具有下列特点：

1. 即开即用，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。

2. 有粗提和精提两个选择，但是精提需要超速离心机。粗提所得线粒体可以直接用于蛋白分析（SDS-PAGE、Western Blot、ELISA等）、蛋白组分析和线粒体DNA纯化。精提线粒体可以用于偶联分析和体外线粒体蛋白合成等实验。

3. 本产品可以处理约2×108个培养细胞，30 mg培养细胞（相当于15瓶150 mm培养细胞）可以纯化到到0.5-1.5 mg线粒体。

4. 本产品适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不能用于动物实体组织。

5. 提供线粒体染液，可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。

常温运输和保存, 保存期限一年。

操作步骤：

注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或冷室进行，所要用到的溶液和离心管都必须预先冷却，否则线粒体容易破裂。

一：准备工作（此步骤同柱式动物线粒体DNAout中线粒体提取步骤）。未用完的下列溶液需要-20℃保存，否则容易长菌。下次使用前务必让沉淀溶解并摇晃均匀。

1. 将溶液A和溶液B放冰上预冷待用。

2. 配制1.7M高比重溶液（仅仅限111207B精提型试剂盒，111207A粗提型试剂盒不需要配制此溶液）：36克蔗糖用溶液B溶解并定溶到60mL，冰上预冷待用。

3. 配制1.0M低比重溶液，111207A粗提型试剂盒需要100mL，配制方法是将34克蔗糖用溶液B溶解并定溶到100mL，冰上预冷待用。111207B粗提型试剂盒需要150mL，配制方法是将51克蔗糖用溶液B溶解并定溶到150mL，冰上预冷待用。

4. 配制线粒体重悬液，111207A粗提型试剂盒需要200mL，配制方法是将150 mL溶液B和50 mL 1.0M低比重溶液混合；111207B精提型试剂盒需要300mL，配制方法是将225 mL溶液B和75 mL 1.0M低比重溶液混合，即得300mL 线粒体重悬液，冰上预冷待用。

二：线粒体粗提（此步骤同柱式动物线粒体DNAout中线粒体提取步骤）

5. 如果提取材料是单层细胞，先用60 mL 自备的PBS缓冲液洗涤2×108个培养的单层细胞，共洗涤2次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在60 mL PBS缓冲液中。如果是悬浮细胞，则1000g 4℃离心10分钟收集2×108个细胞，再用60 mL PBS缓冲液洗涤2次，将细胞重悬在60 mL PBS缓冲液中。

6. 用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机1000 g 4℃离心10分钟，吸弃上清，保留细胞沉淀。

7. 加入5倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的预冷的溶液A，轻柔重悬细胞。

8. 冰上放置4-5分钟。注意：冰浴时间不要超过5分钟。

9. 如果是成纤维细胞，由于其难以裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置20-30分钟后再化冻，然后进入下步操作。如果不是成纤维细胞，则直接进入下步操作。

10. 将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce玻璃匀浆器中（工作体积为10-15 mL，间隙为0.12 mm，是玻璃材质，否则线粒体产率会降低）匀浆适当次数。细胞株不同，其最适匀浆次数不同，一般需要40次-60次左右。匀浆是线粒体纯化最关键的步骤，故匀浆前先通过预实验确定最适匀浆次数，方法是每匀浆5-10次后，取2-3 uL匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到20%以下为佳。

11. 加入1/3体积的、预冷的1.0 M低比重溶液，轻柔混匀。

12. 用平甩转子离心机4℃ 1000 g离心10分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核，上清液含线粒体。

13. 转移上清液到离心管中，冰上放置。在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50uL左右上清液到载玻片上，再滴入50 uL詹纳斯染液绿B染色液20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。

14. 用固定角度转子（fixed-angle rotor）离心机4℃ 15000 g离心15分钟，弃上清，所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。

15. 用10 mL线粒体重悬液重悬线粒体，4℃ 15000 g离心15分钟，弃上清。

16. 重复上步。

17. 用适量的线粒体重悬液重悬线粒体，可用于各种后续实验（本试剂盒不提供相关试剂），如果用于下面的精提操作，则用10mL线粒体重悬液重悬。

三：线粒体精提（需要超速离心机）

18. 在跟超速离心机匹配的50 mL的离心管中，加入10 mL预冷的高比重溶液，再在上面加上10 mL预冷的低比重溶液，再加上10 mL线粒体粗提液。

19. 70000g 4℃离心40分钟，线粒体将位于高比重溶液和低比重溶液之间区域。

20. 小心用广口吸管吸出线粒体到新的离心管中，加入等体积的线粒体重悬液。

21. 用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机1000 g 4℃离心10分钟，吸弃上清，保留线粒体沉淀。

22. 用10 mL线粒体重悬液重悬线粒体，在平甩转子离心机上4℃ 1000 g离心10分钟，吸弃上清，保留线粒体沉淀。

23. 再重复上步。

24. 用适量线粒体重悬液重悬线粒体，得到线粒体精提液。可以直接用于Lowry法蛋白浓度测定，也可以用于其他后续实验。