储存条件：

蛋白酶磷酸酶抑制剂-20℃保存；其它2-8℃保存。蛋白柱室温避光保存。

有效期：

一年。

注意事项：

● 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。

● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

● 使用性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。

● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。

产品简介：

我司植物样本磷酸化蛋白富集试剂盒是利用磷酸基团与金属的亲和力，采用固定化金属螯合层析（IMAC）的方法富集磷酸化蛋白。可以选择性的对磷酸化蛋白和多肽进行富集和纯化。本试剂盒可以用来提取富集植物样本的的磷酸化蛋白。如需要做其他样本的磷酸化蛋白富集，请联系我司，选择其他货号的试剂盒。

经本试剂盒制备的蛋白样品可用于Western blotting, mass spectrometry, 2D-PAGE和protein arrays 等下游应用。

试剂盒以外自备试剂和仪器

● 移液器、吸头 ● 离心机及离心管

● 涡旋振荡器 ● 冰箱，冰盒

● 生理盐水

使用方法：

使用注意事项：

1. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

2. 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。

3. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。

4. 蛋白样品中不可含EDTA。

5. 上样蛋白样品pH 值必须低于6，蛋白浓度在0.25-0.5mg/ml。

6. 洗涤细胞和组织是不能用PBS 等磷酸盐缓冲液，要用非磷酸盐缓冲液，如50mM HEPES，Tris等或生理盐水。

7. 可以根据自己实验需要加入其它磷酸酶抑制剂单品。

8. 用蛋白柱进行磷酸化蛋白富集，需要离心操作时将蛋白柱置于一个50ml 离心管离心即可。

9. 最终蛋白样品用于2D 电泳前需脱盐。

一、蛋白样品的准备：

以下为由新鲜植物细胞和组织制备蛋白样品的参考步骤，其它方法得到的蛋白样品稀释至蛋白浓度为0.25-0.5mg/ml 后直接上样即可，确保蛋白样品的pH 值低于6。

可以用试剂盒中的洗柱液、裂解液、洗涤液稀释蛋白样品。

植物细胞裂解：

1. 提取液制备：每500ul 冷的裂解液中加入2ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

2. 取植物细胞样本，在4℃，1000Xg 条件下离心5-10 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。

3. 用冷生理盐水洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

4. 每50-100mg 细胞样本中加入500ul 冷的蛋白裂解液，混匀后匀浆处理，然后在4℃条件下振荡15 分钟。

5. 在4℃，14000Xg 条件下离心15 分钟。

6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白裂解液。

植物组织蛋白提取：

1、 裂解液制备：每500ul 冷的提取液中加入2ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂，混匀后置冰上备用。

2、 取200mg 植物组织样本，去除粗筋脉络等后尽可能剪碎，置于研钵中用液氮研磨。（没有液氮条件也可直接置冰上加入裂解液研磨即可）

3、 研磨后加入500ul 提取液，混匀后于一个预冷的干净离心管中在4℃条件下振荡2-3 小时。

4、 在4℃，14000Xg 条件下离心15 分钟。

5、 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。

二、柱平衡：

加入500ul 洗柱液洗柱，重力作用下自然流下或4℃下500g 力离心1 分钟甩干吸附柱。

三、上样：

将以上蛋白裂解液或其它待富集蛋白样品加入吸附柱，重力作用下自然流下或4℃下500g 力离心1 分钟甩干吸附柱。

四、洗柱：

加入300ul 洗涤液洗柱，重力作用下自然流下或4℃下500g 力离心1 分钟甩干吸附柱。重复两次。

五、洗脱：

加入500ul 磷酸化蛋白洗脱液，重力作用下自然流下或4℃下1000g 力离心1 分钟甩干吸附柱，收集洗脱液，即得到磷酸化蛋白。

六、柱保存和柱再生：

我司磷酸化蛋白纯化柱如果保存和处理得当的话可以多次重复使用。

使用后可以用1ml 0.1M EDTA 溶液洗柱，然后在柱中加入20%乙醇溶液密封，置2-8℃保存。

加入0.1M 氯化铁溶液，浸泡蛋白柱填料，即可对蛋白柱进行再生。