终点显色法内毒素定量试剂盒说明书

发布时间:2017/5/11 21:53:00

本试剂盒用于体外细菌内毒素的定量检测,禁止以任何途径进入机体。

检测原理如下:鲎试剂为鲎科动物东方鲎(TAL)的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品, 鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在适宜的条件下(温度,pH 值及无干扰物质),细菌内毒素激活C因子,引起一系列酶促反应,激活凝固酶原形成凝固酶,凝固酶分解人工合成的显色基质,使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺(pNA,λmax=405nm)。在一定时间内,pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关,据此,可以定量样品的内毒素浓度。同时,对硝基苯胺(pNA)也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色(λmax = 545nm),避免了样品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。它具有下列特点:

1. 该试剂盒仅用于体外细菌内毒素的定量检测,严禁试剂以任何途径进入机体。

2. 接触试剂及样品的所有器皿必须是除热原的。实验过程应防止微生物的污染。该说明书中的除热原指内毒素浓度小于0.005 EU/ml。玻璃器皿可经250℃干烤至少60分钟去除热原。

3. 待测样品的pH值应在6.0–8.0之间,若超出此范围,需用除热原的缓冲液、0.1M氢氧化钠或0.1M盐酸调节。

4. 当样品中可能存在鲎实验的干扰物质时,须进行干扰实验。


常温运输,4℃避光保存,有效期两年。


使用方法:

1. 样品的贮存与预处理

1.1 样品中可能含有β-葡聚糖(β-葡聚糖会产生G因子旁路反应,干扰内毒素检测),需选用特异性鲎试剂。

1.2 若样品为一些抗菌素如头孢类抗菌素和磺胺制剂会对偶氮染色剂产生偶联反应而干扰偶氮化显色,需要选用不含偶氮化试剂的试剂盒。

1.3 若样品的本底吸光度值大于0.5,必须对样品进行稀释后再检测。

1.4 若样品颜色较深(例如溶血),或在酸性条件下颜色加深(例如一些组织培养介质),必须设置样品空白管以扣除样品自身的颜色本底。样品空白管不加入鲎试剂,以等体积鲎试剂的溶剂(该处为细菌内毒素检查用水)

代替。其余操作同样品管。

2. 实验操作

2.1 细菌内毒素标准溶液配制

标准曲线所采用的内毒素浓度可以为0.01, 0.025, 0.05, 0.1EU/mL 或0.1, 0.25, 0.5,1.0EU/mL。稀释方法如下(以0.1, 0.25, 0.5, 1.0 EU/mL为例):取细菌内毒素标准品1支,按细菌内毒素标准品使用说明书稀释为10EU/mL的内毒素溶液,再稀释为1.0EU/mL的内毒素溶液,以1.0EU/mL的内毒素溶液为母液按下表稀释成0.1,0.25,0.5,1.0 EU/mL的浓度梯度。配制好的内毒素标准溶液应在4小时内用完。

2.2 阴性对照为细菌内毒素检查用水。

2.3 鲎试剂、显色基质、偶氮化试剂等的溶解

鲎试剂:按标示量加细菌内毒素检查用水于鲎试剂中,轻轻振摇使鲎试剂完全溶解, 注意不要用旋涡混匀剧烈振摇。溶解的鲎试剂应在10分钟内用完。显色基质:按标示量加细菌内毒素检查用水于显色基质中,轻

轻振摇使显色基质完全溶解。显色基质溶液可在无污染的条件下于4 oC贮存8小时以内。

偶氮化试剂1:按标示量加反应终止剂盐酸于偶氮化试剂1中,

偶氮化试剂2:按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂2中,

偶氮化试剂3:按标示量加细菌内毒素检查用水于偶氮化试剂3中,

偶氮化试剂溶液可于4oC贮存1周。

2.4 实验操作

取无热原试管,加入100 uL细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液,或待测样品。再加入100 uL鲎试剂溶液,混匀,37oC温育T1分钟。温育结束,加入100 uL显色基质溶液,混匀,37oC温育T2分钟。温育结束,加入500 uL偶氮化试剂1溶液,混匀,加入500uL偶氮化试剂2溶液,混匀加入500 uL偶氮化试剂3溶液,混匀,静置5分钟,于545nm波长处读取吸光度值

本试剂盒建议反应时间T1及T2如下:

内毒素标准范围(EU/mL)为0.01-0.1,T1为60分钟,T2为6分钟;

内毒素标准范围(EU/mL)为0.1-1,T1为10分钟,T2为6分钟。