ATP生物发光技术的原理是荧光素酶（Luciferase）以荧光素（Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）和O2为底物，在Mg2＋存在时，能将化学能转化为光能。ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源。在荧光素酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系。

研究表明，各生长期的细菌均有较恒定水平的ATP含量，因此，提取细菌的ATP，利用生物发光法测出ATP含量后，即可推算出样品中的含菌量，整个过程仅为十几分钟。由于生物发光法无需培养微生物过程，操作简便、灵敏度高，在短时间内即可得到检测结果，具有其他微生物检测方法无可比拟的优势，是目前检测微生物最快的方法之一。

本试剂盒采用生物发光（bioluminescent）法，利用Firefly luciferase（萤火虫荧光素酶）催化底物Luciferin（荧光素）的转化，高效利用ATP的能量，发射出光子。发光信号与存在的ATP量呈正比，而ATP与存在于培养基中的细胞数目直接呈正比。ATP的检测灵敏度达到10-13 mol，故具有极高的敏感性。本试剂盒采用优化的酶反应体系，使发光反应持续数十分钟，便于手工操作多个样品。操作简便，可快速获

得结果。该产品特点如下：

1. 高度敏感：灵敏度达到10-13 mol

2. 快速简便：加入制剂后迅速获得结果低温保存和运输， -20℃或-80℃避光保存，有效期6个月

样品准备：

对于细胞或微生物样品，应首先提取ATP 。本试剂盒提供培养哺乳细胞的ATP 提取方法如下。其它标本来源的ATP 提取，一般可用三氯乙酸的提取方法，或参照文献一些有效提取方法进行。对体外酶促反应样品，一般可直接用双蒸水稀释后进行检测。

样品中

ATP 含量应稀释到0.1 mM以下，以保证在测定的线性范围内。

培养哺乳细胞样品准备：

1) 配制裂解液：临用前，取适量100x细胞裂解液，用双蒸水稀释至1x，混匀。1x细胞裂解液可长期冻存于-20℃。

2) 细胞清洗：倾去培养板/皿中的培养液，加入足量PBS ，轻轻洗涤细胞。完全倾去洗涤液。

3) 细胞裂解：在孔/皿中加入足量1x细胞裂解液，混匀。培养板可在微型振荡器上震荡5~10 min；培养皿可直接用细胞刮刀刮下细胞，将细胞悬液移入1.5 ml离心管，在涡旋振荡器上充分混悬震荡30 秒。裂解细胞悬液可直接用于发光测定，也可离心30 秒，取上清做发光测定。裂解细胞含量较多时，可将样品用双蒸水稀释，以保证在测定ATP 的线性范围内。

配制发光反应液：

测定前，在室温待（ATP 反应缓冲液）ATP Assay Buffer 和荧光素（Luciferin）溶化，混匀（注意避光）。按20/1 比例用ATP assay Buffer稀释Luciferin，再加入1/10 体积的荧光素酶（Luciferase），配制所需体积的Assay Reagent（注意避光），置冰上待用。

配制ATP 标准液：

测定前，在室温待ATP 溶化，用双蒸水或1x细胞裂解液稀释成一定浓度梯度的溶液。该浓度梯度应在0.1 nM~0.1 mM的浓度范围内的一定区间，并涵盖样品ATP 浓度的测定范围。

测定仪器的设置：

按仪器操作说明开启发光测定仪。手动操作型仪器，将测读时间设为10-20秒。自动操作型仪器，一般将测定延迟设为2秒，将测读时间设为10-20秒，Assay Reagent的注入体积设定为50 μl。

手动发光测定：

取待测样品5 μl加入测量管底部，取Assay Reagent 50 μl加入管底部，轻轻敲击管壁3~5次混匀，放入仪器中立即测定，记录发光值为Firefly luciferase的发光单位(RLU) 。如用多孔板同时手动测定多个样品，则将各待测样品5 μl分别加入连续的各孔底部，用多道加样器于各孔底加入Assay Reagent 50 μl，轻轻敲击板侧3~5次混匀，放入仪器中立即测定，记录发光值为Firefly luciferase的发光单位(RLU) 。

自动发光测定：

配制好的Assay Reagent置于测定仪内并连接好对应管道。各待测样品5 μl分别加入测定管/板孔底部，启动自动测量程序。记录Firefly luciferase的发光单位(RLU) 。