分枝杆菌属（Mycobacterium）是极为古老的细菌，与人类的疾病相关的就有25种以上，包括引起结核病的结核分枝杆菌（Mycobacteria tuberculosis）。近年来由于多重耐药性分枝杆菌的出现，分枝杆菌再次成为人们关心的细菌。PCR快速诊断是目前检测分枝杆菌的主流方法，但由于此类细菌具有十分独特的坚硬的细胞壁，快速提取其基因组DNA一直是十分棘手的技术问题。本产品就是为解决这一问题而开发，具有下列特点：

1. 操作简单，客户不需要准备额外的试剂。

2. PCR检测灵敏度一般在10-100CFU/mL样品。

3. 既可以使用培养的细菌，也可以使用痰液、精液、血液、脑脊液等样品。

4. 价廉物美，与国外同类产品相比质量相当，但价格便宜。

5. 安全无毒，本试剂盒对人体无害，无腐蚀性和刺激性气味。

常温运输及保存，有效期一年。

注意：文献报道部分分枝杆菌在DNA提取过程中还有形成菌落的能力，所以任何丢弃的溶液都必须按有传染性的污染物品对待，并严格按有关部门要求进行消毒处理。

一: 培养的分枝杆菌样品的预处理

1. 刮取培养的分枝杆菌到0.5 mL 自备TE缓冲液中。

2. 80℃放置20分钟以杀灭细菌。

3. 3000 g室温离心15分钟，弃上清。

4. 细菌沉淀放-20℃冰箱备用或直接进入细菌基因组DNA提取步骤。

二: 含分枝杆菌的痰液样品的预处理

1. 将需要处理的痰液样品加入到干净的10 mL或15 mL塑料离心管中。

2. 加入等体积的化痰液，充分混合均匀后室温放置15-30分钟。如果痰很浓，可以延长保温时间。

3. 3000 g室温离心15分钟，弃上清。

4. 细菌沉淀放-20℃冰箱备用或直接进入细菌基因组DNA提取步骤。

三: 含分枝杆菌的血液样品的预处理

1. 用自备红细胞裂解液对血液进行红细胞裂解处理，具体操作见百奥莱博红细胞裂解液（BTN60403）使用手册。

2. 将得到的白细胞沉淀-20℃或更低温度放置10分钟。

3. 迅速将得到的白细胞沉淀100℃加热10分钟。

4. 上述处理将使大部分白细胞破裂，加入自备的TE 或PBS缓冲液,直到离心管体积的一半位置。此步使白细胞的DNA进入缓冲液中。

5. 离心5-10分钟沉淀细菌，离心速度取决于离心管的大小。如果样品在1.5 mL离心管，则可以12000-15000 g室温离心。如果样品在10-15 mL离心管，则3000-5000 g室温离心。

6. 吸弃上清(含白细胞DNA)后所得细菌沉淀可以放-20℃冰箱备用或直接进入细菌基因组DNA提取步骤。

四: 细菌基因组DNA的提取

1. 将150 uL 65℃预热过的溶液A加到有细菌沉淀的离心管中，充分震荡混匀。

2. 将细菌和溶液A的混合物转移到一个干净的1.5 mL塑料螺旋盖离心管中。强烈建议不要使用压盖式塑料离心管，否则后面处理过程中溶液容易漏出。

3. 加入300 uL 溶液B和300 uL 自备氯仿，充分震荡混匀。

4. -20℃放置直到液体凝固，一般需要20-60分钟。过夜放置也可。

5. 放室温融化后振荡半分钟。

6. 12000-15000 g室温离心3-5分钟，小心转移上清到离心吸附柱中，室温放置2分钟。

7. 12000-15000 g室温离心半分钟，弃穿透液。

8. 加入0.5 mL通用洗柱液 12000-15000 g室温离心半分钟，弃穿透液。

9. 重复第8步的洗涤过程。

10. 短暂离心半分钟。此步不要省略，否则残留的洗柱液（含乙醇）将会影响DNA电泳、酶切和PCR等反应。

11. 将离心吸附柱转移到一新的离心管中，加入30-100uL DNA洗脱液2.0，12000-15000 g室温离心半分钟，所得溶液即基因组DNA。

12. 直接取5-10 uL电泳检测DNA，其余放冰箱备用或用于后续反应。