测定意义：

NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH 氧化为NAD。该酶不仅参与NAD 的再生，而且与免疫反应密切相关。

测定原理：

NOX 能够将NADH 氧化为NAD，NADH 的氧化与2,6 二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP 被还原为无色的DCPIP，在600nm 下测定蓝色DCPIP 的还原速率计算出NADH 氧化酶活性的大小。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、蒸馏水

试剂的组成和配制：

试剂一：液体100mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：液体20mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：液体1.5mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂四：液体25mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入5mL 蒸馏水，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

① 准确称取0.1g 组织或收集500 万细胞，加入1mL 试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆600g，4℃离心5min。

③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心10min。

④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的NOX（此步可选做）。

⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL 试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10 秒，重复30 次），用于NOX 活性测定。

血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定

（1）试剂四于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

（2）在微量石英比色皿或96 孔板中加入10μL 样本、200μL 试剂四和40μL 试剂五，混匀，记录600nm 处20s 时吸光值A1 和 1min20s 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

NOX 活力单位的计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）NOX 活力的计算:

单位的定义：每mL 血清（浆）在每mL 反应体系中每分钟A600 变化0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T=2500×ΔA

2、组织、细菌或细胞中NOX 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白在每mL 反应体系中每分钟A600 变化0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织在每mL 反应体系中每分钟A600 变化0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/g 鲜重）=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1 万个细菌或细胞在每mL 反应体系中每分钟A600 变化0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/104 cell）=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V 反总：反应体系总体积，0.25mL； V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细胞或细菌总数，500 万。

b.使用96 孔板测定的计算公式如下：

1、血清（浆）NOX 活力的计算:

单位的定义：每mL 血清（浆）在每mL 反应体系中每分钟A600 变化0.005 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T=5000×ΔA

2、组织、细菌或细胞中NOX 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白在每mL 反应体系中每分钟A600 变化0.005 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.005÷T=5000×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织在每mL 反应体系中每分钟A600 变化0.005 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/g 鲜重）=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.005÷T=1010×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1 万个细菌或细胞在每mL 反应体系中每分钟A600 变化0.005 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/104 cell）=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.005÷T=2.02×ΔA

V 反总：反应体系总体积，0.25mL； V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液

体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细胞或细菌总数，500 万。