储存条件：

-20℃避光保存。

有效期：

六个月。

注意事项：

● 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。

● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。

● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。

● 使用性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。

● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。

产品简介：

活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。

DHR 活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针DHR 进行活性氧检测的试剂盒。DHR可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS 氧化，形成发绿色荧光的Rho123，并稳定存在于细胞内。根据活细胞中荧光的产生，可以判断细胞ROS 含量的多少和变化。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中ROS 经典检测方法。

用488nm 激发，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光，从而测定细胞内活性氧水平。

本试剂盒可以用于各种真核培养细胞、培养或灌流组织及组织冰冻切片的检测。本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂，以便于活性氧的检测。

产品特点：

● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；

● 背景低，灵敏度高；

● 线性范围宽，使用方便。

试剂盒以外自备试剂和仪器

● 培养基 ● 移液器及吸头 ● 离心机

● 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，激发波长488nm，发射波长530nm。

使用方法：

使用注意事项：

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液

体洒落。

● 荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

● 探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标

记情况是否正常。

● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。

● 对于药物作用时间较短(2 小时以内)的细胞，先标记探针，后用药物刺激细胞。对于药物作用时

间较长(6 小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照诱导剂或相应的药物刺激细胞，后标记探针。

● 阳性对照诱导剂可以按照1:1000 的比例使用。例如标记好探针的细胞共1 毫升，可以加入1 微升

的阳性对照诱导剂刺激。通常刺激后20-30 分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于

不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30 分钟内观察不到活性氧

的升高，可以适当提高活性氧阳性对照诱导剂的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活

性氧阳性对照诱导剂的浓度。

● DHR 在光照和空气中易被氧化，注意避光密封保存。

● 对不同的细胞和组织，应选择合适的孵育时间和浓度，以观察ROS 的变化，很多细胞内的ROS 绝

对水平较低，需要根据实际情况适当延长孵育时间。

● DHR 探针可以根据需要的用量分装后冻存，避免反复冻融。

● DHR 不可以性全部稀释后长期保存不用，稀释后稳定性变差，有效期缩短。

DHR 探针配制：

根据需要的用量，用探针稀释液5 倍稀释DHR 探针后充分混匀，避光保存备用。

稀释后的DHR 荧光探针在一个月内用完，尽量避免反复冻融。

DHR 探针标记：

1、 DHR 溶液可在新鲜无血清培养基、缓冲盐溶液或组织灌流液中稀释到所需浓度，100-200 倍稀释，以此染色液更换细胞培养液或灌流液；也可直接向无血清细胞孵育液体或灌流液中加入DHR 探针溶液至所需浓度。

2、 依据细胞ROS 含量的不同，DHR 终浓度可选择在100-200 倍稀释的范围，孵育时间可选择1-4 小时，在37℃或室温进行避光孵育。

3、 孵育结束后，用PBS 等新鲜溶液清洗细胞或组织。漂洗时间要短。

荧光显微镜观察：

1、 对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取25-50μl 细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。

2、 荧光显微镜下观察。

流式细胞仪分析：

1、 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用0.5~1 ml 冰冷PBS 重悬细胞（5~10 万）。

2、 采用488nm 波长激发，测定待测细胞平均荧光强度。