辣椒及其制品辣度ELISA检测试剂盒（货号：Ounuo97002）

使用说明书    本品采用竞争性酶免检测技术用于辣椒及其制品辣度的定量分析，可满足96次测试，在做复孔的情况下，一次可检测42个样本。

产品特性：

? 快速（＜10min）、高回收（≥80%）和高效的前处理方法

? 检测限1度辣度，定量限2度辣度

? 快速，检测时间30min

? 高的重现性

原理：
基于竞争性免疫检测原理：辣椒素与预包被在板上的辣椒素蛋白偶联物竞争结合有限的抗辣椒素的抗体，然后加入酶结合物反应，形成酶结合物—抗辣椒素抗体—辣椒素蛋白偶联物复合物，洗涤除去未结合的反应物，经TMB底物显色产生蓝色产物，加终止液后，产物由蓝色转变为黄色，其在450nm下有显著吸收峰。样本中辣椒素含量与样本的吸光度呈负相关。 

使用前须知：

1. 当与仪器方法结果相比时，试剂盒的结果偏高这是很正常的现象。因为仪器方法仅测量的单一化合物，而试剂盒中的抗体由于不仅能识别目标分子且还能识别结构上相似的分子，包括其相关的代谢产物。因此，使用人员需要明白本产品的局限性和对数据做出合理的分析。

2. 任何试剂、检测程序的改变都可能导致检测失败。

3. 不要使用超过有效期的产品；不同批次的产品不得混用。

4. 实验用水的质量很重要，请使用蒸馏水或去离子水。

5. 微孔板开封后，需置于有干燥剂的密封袋中冷藏保存，建议于一个月内使用完。

需要但未提供的设备和试剂：

? 酶标仪：配备450nm波长

? 单道移液器：0.5-10、20-200、100-1000μL、0.5-5mL量程各一支

? 多道移液器：30-300μL量程一支

? 白色、黄色和蓝色吸头若干 

? 恒温培养箱? 均质器或绞肉机

? 甲醇，分析纯? 二甲基亚砜，分析纯 

1.样本前处理准备

(1) 样本提取液      

分别取甲醇70mL和二甲基亚砜 30mL混匀备用。

(2) 1×样本稀释液      

取4×样本稀释液1份，加入3份去离子水混匀，比如1mL+3mL    

辣椒油、火锅底料

火锅底料、凝固性油样，可以加热至样品溶化后再称量

(1) 称取0.2g均质的样本于一合适的容器中，加入10mL样本提取液涡旋2min;

(2) 4000rpm，离心5min；

(3) 取上层液体0.1mL，加入9.9mL去离子水混匀；

(4) 再取0.1mL上一步混匀后溶液，加入0.9mL去离子水混匀

(5) 再取0.1mL上一步混匀后溶液，加入0.1mL1×样本稀释液混匀

稀释倍数：1

干辣椒  

粉碎后，过40目筛

(1) 称取0.2g均质的样本于一合适的容器中，加入10mL样本提取液涡旋2min;

(2) 4000rpm，离心5min；

(3) 取上层液体0.1mL，加入9.9mL去离子水混匀；

(4) 再取0.1mL上一步混匀后溶液，加入0.9mL去离子水混匀

(5) 再取0.1mL上一步混匀后溶液，加入0.1mL1×样本稀释液混匀

稀释倍数：1

新鲜辣椒以及辣椒酱等辣椒制品    

在均质器或料理机上均质呈匀浆

(1) 称取0.2g均质的样本于一合适的容器中，加入10mL样本提取液涡旋2min;

(2) 4000rpm，离心5min；

(3) 取上层液体0.1mL，加入9.9mL去离子水混匀；

(4) 再取0.1mL上一步混匀后溶液，加入0.9mL去离子水混匀

(5) 再取0.1mL上一步混匀后溶液，加入0.1mL1×样本稀释液混匀

稀释倍数：1

2. 检测步骤检测前准备

• 所有试剂需回复至室温（在20-25℃下，从试剂盒中取出并放置1-2h）;

• 检测开始前需准备好所需试剂；

• 取出所需体积的试剂，其余放回盒内；

• 未使用完的试剂请勿倒回原试剂瓶内，移取每一种试剂需更换吸头，以免交叉污染；

• 请不要在通风口、阳光直射下检测，以避免造成微孔微环境差异导致检测失败；

• 标准品、阳性样本以及用过的吸头和器皿均应做有毒废弃物处理。

洗液（1×）配制

取1体积的20×浓缩洗液，加入19体积的去离子水或蒸馏水混匀 

检测步骤

移取50μL辣椒素标准品至相应微孔中；

移取50μL样本至相应微孔中；

移取50μL酶结合物至所有微孔中；

加入50μL辣椒素抗体至每一所需微孔中，用手指肚轻轻敲击微孔板架两侧混匀1min；

室温（20-25℃）孵育20min；

甩干微孔板，加入300μL 洗液（1×），浸泡5s后倒出洗液，再重复4次，甩干并于无尘布上拍干；

加入100μL底物，室温（20-25℃）避光孵育10min;

加入100μL终止液，于450nm下读数。 

3. 结果计算

(1)以logit(B/B0）为y轴，以log（分析物浓度）为x，进行线性拟合。

其中公式如下a. logit(B/B0)=k ln?〖(concentration)+c〗①

b. B为标准品或样本对应的吸光度；

c. B0为零标准品对应的吸光度；logit(B/B0)=〖ln(〗?〖(B/B0)/(1-B/B0))〗;

d. K为斜率；

e. C为截距

(2)计算出样本的平均吸光度和样本的B/B0值代入公式①中求出浓度并乘以对应的稀释倍数，即为样本中待测物最终浓度；辣度换算公式【求得的浓度C样，（C样×1.142）/10，即为样本的辣度】