小鼠抗双链DNA抗体/天然DNA抗体(dsDNA)ELISA试剂盒检测原理

Elisa试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

小鼠抗双链DNA抗体/天然DNA抗体(dsDNA)ELISA试剂盒样品收集、处理及保存方法

1.  血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.  血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.  细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.  组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1.     酶标仪（450nm）

2.     高加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.     37℃恒温箱

小鼠抗双链DNA抗体/天然DNA抗体(dsDNA)ELISA试剂盒操作注意事项

1.  试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.  实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.  标准品稀释液即可视为阴性对照或者空白；预处理后的样本无需稀释，直接取10μL加样即可。

4.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.  所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：80、40、20、10、5、2.5 pg/ml

试剂的准备

 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

2.  自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

小鼠抗双链DNA抗体/天然DNA抗体(dsDNA)ELISA试剂盒操作步骤

1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.  待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

4.  随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

Elisa包被的条件

包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH 等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用 pH9.6 的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2 的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL 缓冲液作为稀释液的。通常在 ELISA 板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2 小时被认为具有同等的包被效果。包被的适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-2 0ug/ml。

封闭

封闭 (blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA 其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。常用的封闭剂是0.05%-0.5%

的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其的特点是价廉，可以高浓度使用(5%)。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。封闭是否必要，取决于 ELISA 的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA 固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的(见2.2.2)。包被好的E LISA 板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月。

结合物

结合物即酶标记的抗体(或抗原)，是 ELISA 中关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体(或抗原)的免疫活性。结合物中酶与抗体(或抗原)之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的(未结合的)酶或游离的抗体(或抗原)。此外，结合物尚要有良好的稳定性。

小鼠抗双链DNA抗体/天然DNA抗体(dsDNA)ELISA试剂盒结合物的制备

酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。

( 1)戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。ELISA 中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效(结合率达60%-70%)和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中， 先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1 的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。

( 2)过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP 分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成 Schiff 氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其比例为：酶/抗体=1-2/1 。此法简便有效，一般认为是HRP 可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。

按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响 ELISA 中后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取得的分离效果，但费用较贵。

结合物制得后，在用作 ELISA 试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济，又可使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的灵敏度，达到合适

的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的稀释度。例如某一 HRP：抗人IgG 制剂标明的工作浓度为1:5000，表示该制剂经1:5000 稀释后，在与人 IgG 包被的固相作ELISA试验时，将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的稀释度作为试剂盒中的工作浓度。