小鼠抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)ELISA试剂盒检测原理

Elisa试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

小鼠抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)ELISA试剂盒样品收集、处理及保存方法

1.  血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.  血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.  细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.  组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1.     酶标仪（450nm）

2.     高加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.     37℃恒温箱

小鼠抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)ELISA试剂盒操作注意事项

1.  试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.  实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.  标准品稀释液即可视为阴性对照或者空白；预处理后的样本无需稀释，直接取10μL加样即可。

4.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.  所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：80、40、20、10、5、2.5 pg/ml

试剂的准备

 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

2.  自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

小鼠抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)ELISA试剂盒操作步骤

1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.  待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

4.  随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

Elisa包被的条件

包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH 等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用 pH9.6 的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2 的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL 缓冲液作为稀释液的。通常在 ELISA 板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2 小时被认为具有同等的包被效果。包被的适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-2 0ug/ml。

封闭

封闭 (blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA 其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。常用的封闭剂是0.05%-0.5%

的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其的特点是价廉，可以高浓度使用(5%)。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。封闭是否必要，取决于 ELISA 的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA 固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的(见2.2.2)。包被好的E LISA 板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月。

结合物

结合物即酶标记的抗体(或抗原)，是 ELISA 中关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体(或抗原)的免疫活性。结合物中酶与抗体(或抗原)之间有恰当的分子比例，在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的(未结合的)酶或游离的抗体(或抗原)。此外，结合物尚要有良好的稳定性。

小鼠抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)ELISA试剂盒酶要求

用于ELISA的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。在受检标本中不存在相同的酶。另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。

在 ELISA 中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosohatase, AP)。在少数商品ELISA 试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。

国产 ELISA 试剂一般都用HRP 制备结合物。HRP 是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶( 酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成，是一种卟啉蛋白质。主酶无色糖蛋白在275nm 波长处有吸收峰，辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm 波长处有吸收峰。HRP 的纯度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意为纯度数)表示，是403nm 的吸光度与280nm 吸光度之比，高纯度的HRP的RZ≥?.0。

HRP 除符合上述的ELISA 中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较稳定的特点。值得注意的是，在选用酶制剂时，除其纯度RZ 外，更应注意酶的活力。高纯度的酶如保存不当，活力也会降低。酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示，可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验。

国外很多 ELISA 试剂采用碱性磷酸酶(AP)作为标记酶。常用的AP 有两个来源，分别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特性特性略不相同，从大肠杆菌中提取的 AP 分子量为80000，酶作用的适合pH 为8.0；用小牛肠膜中提取的AP 分子量为10 0000，适pH 为9.6。在ELISA 中，AP 系统的敏感度一般高于HRP 系统，空白值也较低，但AP 价格昂贵，制备结合物所得率也较 HRP 低。

抗原和抗体

制备结合物时所用抗体一般均为纯度较高的 IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。用亲和层析纯的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。如用F(ab')2 进行标记，则更可避免标本中RF 的干扰。在ELISA 中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。