微量水分测定仪的工作原理基于一种专一性的化学反应，即卡尔·费休反应。该反应利用碘、二氧化硫在碱性环境和醇类溶剂存在下，与水发生定量消耗的关系来测定样品中的水分含量。其核心化学反应过程如下：
　　当卡尔·费休试剂与含有水分的样品接触时，试剂中的碘（I2）会与二氧化硫（SO 2）及碱（如咪唑或吡啶）和醇（通常为甲醇）共同作用，将水分子完全消耗掉。在这个反应中，1个分子的碘恰好与1个分子的水发生反应。只要样品中还有水存在，加入的碘就会立即被消耗，溶液中就不会有过量的碘游离出来。只有当样品中的水被完全反应完毕后，稍微过量的碘才会出现在溶液中，此时反应达到终点。
　　根据检测终点和计算方式的不同，仪器主要分为两种工作模式：
　　1.容量法工作原理：
　　这种方法通过滴定管向样品池中滴加已知浓度的卡尔·费休试剂（滴定剂）。仪器内部的双铂电极会监测溶液的电导率变化。在水分未反应完之前，溶液不导电或导电性极弱；一旦水分被完全消耗，多余的碘使溶液导电性瞬间增强，电极检测到电流突变，仪器自动停止滴定并记录消耗的试剂体积。由于试剂浓度已知，根据“消耗的试剂体积×试剂浓度”即可计算出样品中的水分总量。这种方法适用于水分含量较高的样品。
　　2.库仑法工作原理：
　　这种方法不需要预先加入含碘的试剂，而是直接在电解池内产生碘。电解池中包含阴阳两极，通电后，阳极上的碘离子失去电子生成碘单质。生成的碘立即与样品中的水反应。只要样品中还有水，反应就会持续消耗碘，导致电路保持导通状态，不断产生新的碘。当水分反应完毕，过量的碘出现，电极检测到电位变化，仪器自动切断电源。根据法拉第定律，电解产生的碘量与通过的电量成正比。仪器通过精确测量电解过程中消耗的总电量，直接换算出样品中的水分质量。这种方法灵敏度极高，适用于微量甚至痕量水分的测定。
　　无论哪种方法，整个反应过程必须在严格密封的干燥环境中进行，以防止空气中的水分进入干扰测试结果。仪器通过自动判定反应终点，结合化学计量关系或电量守恒原理，最终得出样品中精确的水分含量。