分光光度计的原理介绍

发布时间:2020-08-07 11:29

    分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源;


    光源透过测试的样品后,部分光源被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。


    核酸的定量


    核酸的定量是分光光度计使用频率的功能。


    可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA。核酸的吸收峰的吸收波长260nm。


    每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。


    如:1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度。


    测试前,选择正确的程序,输入原液和稀释液的体积,尔后测试空白液和样品液。


    然而,实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器,表现出的吸光值漂移越大。


    事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度。


    如EppendorfBiophotometer的准确度≤%(1A)。%左右之间变动,都是正常的。另外,还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值,离子浓度等:


    在测试时,离子浓度太高,也会导致读数漂移,因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液,如TE,可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:


    由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。


    为了减少颗粒对测试结果的影响。在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。


    从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。是操作因素,如混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值;


    混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大;


    换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。


    除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品,比值大于(DNA)(RNA)。


    如果比值低于,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。


    A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品,A320一般是0。

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