紫外分光光度计：从原理到应用的深度解析

一、紫外分光光度计的定义与核心原理

定义：
紫外分光光度计是利用物质对紫外 - 可见光（通常波长范围 200-800nm）的吸收特性，通过测量吸光度来定量分析物质浓度的精密分析仪器。
核心原理：

• 朗伯 - 比尔定律（Lambert-Beer Law）：A=ε?c?l，其中：

• A 为吸光度，

• ε 为摩尔吸光系数（物质特性常数），

• c 为溶液浓度，

• l 为光程（通常 1cm 比色皿）。

• 物质分子中的共轭双键、芳香环等基团会吸收特定波长的光，吸光度与浓度呈线性关系，从而实现定量分析。

二、仪器结构与关键组件

紫外分光光度计由五大核心模块组成：

1. 光源系统

• 紫外区：氘灯（波长 190-400nm），发射连续紫外光；

• 可见区：钨灯 / 卤钨灯（波长 320-800nm），覆盖可见光范围；

• 高端仪器：使用氙灯（全波段覆盖，190-1100nm），稳定性更高。

2. 单色器

• 作用：将复合光分解为单色光，通过光栅或棱镜实现；

• 关键指标：波长精度（如 ±0.5nm）和带宽（如 1nm，带宽越窄分辨率越高）。

3. 样品室

• 比色皿：

• 石英比色皿：适用于紫外区（紫外光透过率高）；

• 玻璃比色皿：仅用于可见光区（紫外光吸收强）；

• 自动进样器：高端机型支持多通道样品自动检测，提升效率。

4. 检测器

• 光电管：适用于单波长低精度检测；

• 光电倍增管（PMT）：灵敏度高，响应速度快，广泛用于科研仪器；

• 电荷耦合器件（CCD）：可同时检测多波长，适合全光谱扫描。

5. 数据处理系统

• 软件功能：基线校正、光谱扫描、浓度计算（内置标准曲线）、数据导出（Excel/CSV）；

• 显示方式：触摸屏或外接电脑，部分机型支持联网质控。

三、分类与典型机型

根据光路设计，紫外分光光度计可分为三类：

四、核心应用领域与案例

1. 生物化学与分子生物学

• 核酸 / 蛋白质定量：

• DNA 浓度：A???nm 吸光度，1 OD≈50 μg/mL dsDNA；

• 蛋白质浓度：A???nm（酪氨酸 / 色氨酸吸收）或 Bradford 法（A???nm）。

• 酶活性检测：如乳酸脱氢酶（LDH）活性通过 NADH 在 340nm 的吸光度变化测定。

2. 药物分析与质量控制

• 原料药纯度检测：如阿司匹林在 276nm 处的特征吸收；

• 制剂含量测定：药典方法中 90% 以上的药物需紫外分光光度法检测（如维生素 C 片的含量测定）。

3. 环境监测

• 水质分析：

• 总氮（HJ 636-2012）：220nm 与 275nm 双波长法；

• 重金属离子：如六价铬与二苯碳酰二肼显色后测 540nm 吸光度。

• 空气污染物：甲醛与乙酰丙酮显色后测 414nm 吸光度（GB/T 15516-1995）。

4. 食品与农产品检测

• 食品添加剂：苯甲酸（225nm）、山梨酸（254nm）的含量测定；

• 农药残留：有机磷农药经衍生化后测紫外吸收（如甲胺磷的检测）。

五、操作关键步骤与注意事项

1. 标准流程

1. 开机预热：氘灯需预热 30 分钟，钨灯预热 15 分钟，确保光源稳定；

2. 波长校正：使用标准物质（如重铬酸钾溶液）校准波长精度；

3. 基线校正：用空白溶剂（如乙醇、水）扫描基线，消除背景干扰；

4. 样品测定：

• 溶液需过滤（0.45μm 滤膜），避免颗粒散射；

• 比色皿需用样品润洗 3 次，避免残留溶剂稀释样品；

5. 数据处理：通过标准曲线（至少 5 个浓度点）计算样品浓度。

2. 常见问题与解决方案

、行业标准与法规依据

• 药典方法：《中国药典》2025 年版通则 0401 “紫外 - 可见分光光度法”；

• 水质检测：HJ 636-2012（总氮）、HJ 535-2009（氨氮，纳氏试剂分光光度法）；

• 食品检测：GB 5009.28-2016（食品中苯甲酸、山梨酸测定）。